High-throughput fourier-transform mid-infrared spectroscopy: a mechanism-based screening approach to antibiotic discovery

Bernardo José Simões de Almeida Ribeiro da Cunha

Key information

Authors:

Bernardo José Simões de Almeida Ribeiro da Cunha (Bernardo José Simões de Almeida Ribeiro da Cunha)

Supervisors:

Cecília Ribeiro da Cruz Calado (Cecília Ribeiro da Cruz Calado); Luís Joaquim Pina da Fonseca (Luís Joaquim Pina da Fonseca)

Published in

09/14/2021

Abstract

Since its golden age, antibiotic discovery has been slowing to a halt. In thirty years, antibiotic resistant infections are expected to cause the death of more people than cancer does now. A solution should stem from cell-based screening, the most successful first-in-class antibiotic discovery platform, which allows a ‘brute force’ approach more likely to produce short-term results. In cell-based screening, the mechanism of action (MOA) is identified after antimicrobial activity, so only potent candidates are detected. One option to increase the ‘screenable’ chemical space is to turn the page on the activity-based paradigm and shift to one based on mechanism. This requires probing the MOA of low-potency antibiotic candidates, which are often good candidates for medicinal chemistry programs, while ensuring sufficient throughput to screen large libraries. However, MOA identification is either slow, low-throughput, difficult to scale, costly, labor-intensive, or a combination thereof. A new discovery strategy requires a different technological approach to MOA identification, for which Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIRS) is well-suited, but its full potential was yet to be investigated. In that regard, we have shown that FTIRS can identify the MOA of commercial antibiotics beyond the biosynthetic pathway level, and often in greater detail than the antibiotic class; we have determined the dose-response of MOA identification, which suggested FTIRS can discover hits from the grey chemical matter, effectively expanding the ‘screenable’ chemical space to low-potency compounds; we have demonstrated that potent compounds are identified, if not by their mechanism then by their inhibitory effect; and validated our protocol for the rapid exclusion of compounds with predominant off-target effects, which is relevant both during hit discovery or lead optimization, with two model organisms, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Furthermore, our fast and high-throughput protocol, entirely based on 96-well microtiter plates, is highly scalable, which enables screening large compound libraries. As such, FTIRS can fuel a new generation of mechanism-based screening assays that may swing the war on infectious diseases back in our favor. Desde a sua época de ouro, a descoberta de antibióticos tem vindo a estagnar. Estima-se que em menos de trinta anos, as infeções resistentes a antibióticos irão causar a morte de mais pessoas do que o cancro atualmente. Uma solução para este problema deve basear-se em ensaios de varrimento com células, a plataforma de maior sucesso na descoberta de antibióticos de primeira linha, e que permite uma abordagem de 'força-bruta' com maior probabilidade de produzir resultados a curto prazo. Nos ensaios baseados em células, o mecanismo de ação (MOA) é identificado depois da atividade antimicrobiana, portanto apenas compostos potentes são detetados. Aumentar o espaço químico detetável requer evoluir do paradigma baseado em atividade para um baseado no mecanismo. Isso requer a capacidade de varrer o MOA de compostos de baixa potência, que costumam ser bons candidatos para programas de química medicinal, com débito suficiente para varrer grandes bibliotecas. Normalmente, a identificação do MOA envolve técnicas lentas, de baixo rendimento, difíceis de escalar, caras, trabalhosas ou uma combinação das mesmas. Uma nova estratégia de descoberta de antibióticos requer uma abordagem tecnológica diferente para a identificação do MOA, para a qual a espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIRS) tem características adequadas, mas o potencial desta técnica ainda não foi esmiuçado. A esse respeito, mostrámos que a FTIRS pode identificar o MOA de antibióticos comerciais em maior detalhe do que a via biosintética, e por vezes do que a classe do antibiótico; determinámos a relação dose-resposta da previsão do MOA, o que sugere que a FTIRS pode identificar compostos da matéria química cinzenta, expandindo efetivamente o espaço químico detetável até compostos de baixa potência; demonstramos que compostos potentes são identificados, se não pelo mecanismo, então pelo efeito inibitório; e validámos o nosso protocolo para a rápida exclusão de compostos com efeitos predominantemente fora do alvo, seja durante a descoberta ou otimização de candidatos a antibióticos, com duas bactériasmodelo, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Além disso, o nosso protocolo é rápido e de alto débito, através de placas de placas de microcultura de 96 poços, e facilmente escalável, o que permite o varrimento de grandes bibliotecas de compostos. Como tal, a FTIRS pode estimular uma nova geração de ensaios de varrimento baseados no mecanismo que podem virar a guerra contra as doenças infeciosas de volta para nosso favor.