Enhancing high-density single-molecule super-resolution imaging

Inês Martins Cunha

Key information

Authors:

Inês Martins Cunha (Inês Martins Cunha)

Supervisors:

Ricardo Henriques; João Miguel Raposo Sanches (João Miguel Raposo Sanches)

Published in

09/25/2023

Abstract

Técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução, como microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM), permitem a visualização de estruturas biológicas com resoluções na ordem de nanómetros com alta fidelidade. Contudo, analisar os extensos datasets adquiridos por estes métodos exige uma grande capacidade computacional. Adicionalmente, a capacidade dos algoritmos de localização de SMLM de resolver estruturas com elevadas densidades de fluoróforos com precisão representa uma limitação fundamental. Esta tese aborda estes desafios através do desenvolvimento de ferramentas computacionais otimizadas, abordagens analíticas e experimentais. Em primeiro lugar, é introduzida uma biblioteca em Python - NanoPyx - desenvolvida para acelerar computação para análise de imagem em super-resolução. Esta optimização é feita através da geração de múltiplas implementações de métodos e com a seleção dinâmica da mais rápida para cada hardware e dataset. Em segundo lugar, foram desenvolvidas simulações realistas de SMLM na biblioteca NanoPyx para sistematicamente avaliar a capacidade de quantificação de moléculas dos algoritmos de localização, revelando um limite de fidelidade de ∼1 molécula/µm2 . Em último lugar, foi desenvolvida uma estratégia experimental envolvendo competição de anticorpos para controlar linearmente a densidade de moléculas com fluoróforos. Variando o rácio de moléculas com e sem fluoróforos, a fidelidade dos algoritmos em contar moléculas pode ser caracterizada para diferentes condições de densidade, em experiênciais reais. O trabalho desenvolvido em otimização computacional, simulação e experiências contribui para um melhoramento na velocidade, fidelidade e caracterização quantitativa de técnicas de microscopia de super-resolução. Super-resolution fluorescence microscopy techniques such as single-molecule localization microscopy (SMLM) enable imaging biological structures at nanoscale resolutions with unprecedented accuracy. However, analysing the large, complex datasets generated by SMLM experiments remains computationally demanding, hindering analysis throughput. In addition, the ability of SMLM localisation algorithms to accurately resolve high densities of fluorescent emitters represents a fundamental limitation. This thesis tackles these challenges through the development of optimised computational tools, analytical approaches and experimentation. First, a Python framework entitled NanoPyx is introduced to accelerate super-resolution image analysis on modern computing hardware. This is done by generating multiple implementations of a task and dynamically predicting the fastest for specific devices and input data. NanoPyx encompasses several methods that can be combined in a full super-resolution image analysis workflow. Next, simulations built within NanoPyx are used to systematically evaluate the counting accuracy of common SMLM localisation algorithms under varying known densities. Results reveal a density limit of 1 molecule/ µm2 for reliable quantification. Building on these simulations, an innovative competitive antibody binding strategy is devised to experimentally control labelling densities in a predictable linear fashion. By tuning the ratio of labelled and unlabelled antibodies targeting microtubules, the density-dependent performance of algorithms is characterised with real datasets. Together, these contributions in computational optimisation, simulation, and controlled experimentation aim to enhance the speed, reliability, and quantitative insights obtainable from single-molecule super-resolution imaging.