Microfluidic separation using aqueous two phase systems

12/12/2018

O despertar do estilo de vida moderno nas últimas décadas aumentou enormemente a importância e necessidade de uma grande variedade de biomoléculas. Como tal, a sua produção foi, ao longo dos anos, muito melhorada para aumentar a disponibilidade de biomoléculas. Todavia, certos sectores, como o da medícina, requerem alto teor de pureza e, como tal, existe actualmente uma crescente demanda por técnicas de separação e purificação que sejam eficientes, escaláveis e economicas. Os sistemas aquáticos bifasicos (ATPS) em particular, têm mostrado um potencial interessante para o processamento de biomoléculas. A primeira fase deste trabalho tem como objectivo o desenvolvimento de um dispositivo microfluidico integrado para a purificação de anticorpos a partir de um meio complexo, usando ATPS como instrumento para acelerar a etapa de concepção de forma económica. Imunoglobulina G (IgG) purificada foi usada como sistema modelo. A partição de IgG marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) num ATPS composto de polietilenoglicol(PEG) e tampão de fosfatos com cloreto de sódio (NaCl) foi testada em vários dispositivos microfluídicos. A estrutura final usada foi um microcanal com 16,8 cm de comprimento com três entradas e três saidas. Difusão completa foi atingida com velocidades menores que 1 µL/min, mas o fluxo dentro do microcanal era instável. Obter o rendimento do processo não foi possível devido a um erro de quantificação, mas valores teóricos atigem os 90% e o coeficiente de partição (Kp), obtido a partir de valores de fluorescência dentro do microcanal, foi de 2,15. Adicionalmente. o sistema provou ser fácil de simular Durante o trabalho desta tese, também tentamos caracterizar o comportmento de ATPS dentro de um dispositivo microfluidico. Assim, microscopia confocal foi usada para determinar como a interface de um ATPS se comporta dentro de um canal microfluidico. Microscopia confocal é uma técnica de microscopia fluorescente que pode isolar planos horizontais de vista e, usando programas informáticos apropriados, reconstruir os planos obtidos num modelo 3D da amostra a ser estudada. Microscopia confocal é uma técnica que necessita fluorescência na amostra e, como tal, insulina marcada com FITC foi usada para este propósito. Devido ao Kp da insulina nos ATPS usados, à volta de 13 para o ATPS de PEG/tampão de fosfatos e à volta de 4 para o ATPS de PEG/dextrano, a adição de insulinaFITC ao ATPS cria um contraste agudo entre as duas fases quando usada em microscopia confocal. Microscopia confocal permitiu-nos ver a interface em condições microfluídicas e determinar que não se trata de uma barreira direita mas sim uma curva que favorece a interação entre a fase rica em PEG e a parede de polidimetilsiloxano(PDMS). The advent of the modern life in the last few decades have brought a greatly increased need for a wide variety of biomolecules. Production of said biomolecules have, thus, been greatly refined to increase their availability. However, certain fields, such as the medical field, require materials with high purity. Thus there is an increasing demand for efficient, scalable and cost-effective techniques for separation and purification of biomolecules. In particular, aqueous two phase systems (ATPS) have shown interesting potential for downstream processing. The first stage of this work has the aim to develop an integrated lab-on-a-chip microfluidic device for antibody purification from complex medium, using ATPS, as a tool to accelerate bioprocess design in a cost-effective manner. Pure immunoglobulin G (IgG) was used as a model system. The partition of IgG tagged with fluorescein isothiocyanate(FITC) in Polyethyleneglycol (PEG)/phosphate buffer with NaCl in ATPS was investigated in a microfluidic device. The final structure was a 16,8 cm microchannel with three inlets and three outlets. Complete diffusion was achieved at volumetric rates lower than 1µL/min. Obtaining the process’s yield was not possible due to a quantification error, but theoretical values reach 90% and the partition coefficient(Kp) was calculated from the fluorescent values at 2,15. Additionally, the system has proven to be easily predictable with simulations from Comsol or other means. During the work of this thesis, we also attempted to characterize the behavior of the ATPS in the microfluidic setting. In order to do this, confocal microscopy was used to determine how the ATPS interface behaves in the microfluidic channel. Confocal microscopy is a fluorescence microscopy technique that can isolate horizontal planes of view and, using appropriate software, reconstruct the planes into a 3D model of the sample. Confocal microscopy requires fluorescence in the sample, therefore insulin marked with FITC was used. Due to the coefficient partition of insulin in the ATPSs used, the introduction of insulin-FITC into the ATPS creates a sharp contrast between the two phases. Confocal microscopy allowed us to see the interface and to determine that it is not a straight barrier but that is curved in a way that favors the interaction between the PEG-rich phase and the PolyDiMethylSiloxane (PDMS) wall. Due to the rising importance of ATPS in separation and purification processes, characterization of said ATPS has also become an essential part of ATPS use. For this purpose a microfluidic platform was devised to quickly characterize the ATPS binodal curve. Stock solutions containing PEG, phosphate buffer and dextran were used to test the microfluidic platform. The microfluidic platform was a 20,5 cm microchannel with a width of 150 µm and a height of 20 µm and three inlets. For each ATPS used as test, two of the appropriated stock solutions were inserted along with milli-Q water into the microchannel.

Authors in the community:

• 

  D

  Daniel Filipe Camarneiro Silva

  ist166899

Supervisors of this institution:

• 

  M

  Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros

  ist12662

101602545

Doutoramento em Biotecnologia e Biociências

biological-sciences - Biological sciences

Keywords

• Soluções aquosas bifasicas
• microfluidos
• separação e purificação de biomoléculas
• microscopia de fluorescência
• determinação de coeficientes de partição
• Aqueous two phase systems
• microfluidics
• separation and purification of biomolécules
• fluorescent microscopy
• determination of partition coefficients

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