Molecular determinants of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate function and organization

Luís Pedro Borges Araújo

Key information

Authors:

Luís Pedro Borges Araújo (Luís Pedro Borges Araújo)

Supervisors:

Fábio Monteiro Fernandes (Fábio Monteiro Fernandes); Manuel Nuno de Sousa Pereira Simões de Melo; Manuel José Estevez Prieto (Manuel José Estevez Prieto)

Published in

05/27/2022

Abstract

O fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PI(4,5)P2) é um fosfolípido de membrana minoritário que desempenha um papel crucial na regulação de vários processos de sinalização no folheto interno da membrana plasmática. A organização lateral do PI(4,5)P2 é fundamental para esse fim. Pensa-se que o PI(4,5)P2 está heterogeneamente disperso pela membrana, em nanodomínios enriquecidos em PI(4,5)P2 presentes em locais e tempos determinados. Foi demonstrado que os catiões divalentes têm a capacidade de induzir a formação de tais nanodomínios, mesmo a concentrações fisiológicas de lípido e catião, tornandose assim em moduladores chave da organização lateral de PI(4,5)P2. Neste trabalho utilizamos uma combinação de espectroscopia e microscopia de fluorescência, e simulações de dinâmica molecular (MD) coarse grained (CG) para estudar determinantes moleculares que regulam a organização lateral de PI(4,5)P2, e o seu potencial impacto na sua função através da modulação das interacções PI(4,5)P2- proteína. Os nossos resultados mostram que o Ca2+ deverá ter um impacto directo nas interacções PI(4,5)P2-proteína através de vários mecanismos. Foi demonstrado que o Ca2+ induz a blindagem da carga do PI(4,5)P2, impactando significativamente a afinidade da ligação PI(4,5)P2-proteína. Foi também demonstrado que as proteínas ligantes de PI(4,5)P2 não são capazes de sequestrar lípidos dos nanodomínios induzidos por Ca2+, provando que estes têm o potencial de compartimentalizar as proteínas ligantes de PI(4,5)P2 e modular interacções entre elas, através de alterações no tamanho dos nanodomínios. O efeito da saturação das cadeias de acilo sobre as alterações dependentes do cálcio nas propriedades globais de membranas contendo PI(4,5)P2 foi também explorado. Enquanto na ausência de catiões divalentes, todas as composições de cadeias de acilo se comportaram da mesma maneira, na presença de Ca2+ as várias composições produziram nanodomínios de PI(4,5)P2 com propriedades biofísicas distintas. Em particular, cadeias de acilo cada vez mais saturadas produziram nanodomínios mais ordenados e estruturados, o que culminou na formação de nanodomínios semelhantes a gel para a composição totalmente saturada. As propriedades biofísicas do PI(4,5)P2 exploradas neste trabalho foram também utilizadas como referência para o desenvolvimento de topologias do PI(4,5)P2, e dos restantes lípidos da família dos fosfatidilinositóis, para o campo de forças CG Martini 3. Estas topologias foram desenvolvidas com um âmbito de aplicação alargado para incluir, entre outras, a reprodução exacta da agregação de fosfatidilinositóis mediada por catiões. No seu conjunto, este trabalho expande o conhecimento sobre a organização lateral do PI(4,5)P2 e dá pistas sobre como alguns dos seus reguladores podem ter um impacto substancial na sua função. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a minority membrane phospholipid that plays a crucial role in the regulation of several signaling processes at the inner leaflet of the plasma membrane. Lateral organization of PI(4,5)P2 is critical to that end. It is thought that PI(4,5)P2 is heterogeneously dispersed across the membrane, in localized PI(4,5)P2-enriched nanodomains at particular sites and timings. Divalent cations were shown to have the ability to induce the formation of such nanodomains, even at physiological concentrations of both lipid and cation, and thus became key modulators of PI(4,5)P2-lateral organization. Here, we use a combination of fluorescence spectroscopy and microscopy techniques, and coarse grained (CG) molecular dynamics (MD) simulations to study molecular determinants that regulate PI(4,5)P2 lateral organization and their impact on its function, via the modulation of PI(4,5)P2-protein interactions. Our results show that Ca2+ is able to directly impact PI(4,5)P2-protein interactions through several mechanisms. Ca2+ was shown to induce charge screening of PI(4,5)P2, significantly impacting PI(4,5)P2-protein binding and affinity. PI(4,5)P2-binding proteins were shown to not be able to fully sequester lipids from Ca2+-induced PI(4,5)P2 nanodomains, proving that these have the potential to compartmentalize PI(4,5)P2-binding proteins, inhibiting, or possibly promoting interactions between them through changes in PI(4,5)P2 nanodomain size. The effect of acyl-chain saturation on the calciumdependent changes on the overall properties of PI(4,5)P2-containing membranes was also reported. While in the absence of divalent cations all acyl-chain compositions behaved in the same manner, in the presence of Ca2+, acyl-chain compositions yielded PI(4,5)P2 nanodomains with significantly different biophysical properties. In particular, increasingly saturated acyl-chains yielded more ordered and structured nanodomains, which culminated in the formation of gel-like nanodomains for the fully saturated composition. The PI(4,5)P2 biophysical properties explored in this work were then used as reference for the development of Martini 3 CG MD topologies of PI(4,5)P2 and the remaining lipids in the phosphoinositide family. These topologies were developed with an expanded application scope to include, among others, accurate reproduction of cation-mediated phosphoinositide aggregation. Altogether, this work furthers the understanding of PI(4,5)P2 lateral organization and hints at how some of its regulators might substantially impact PI(4,5)P2 function.