Functional analysis of Arabidopsis thaliana major facilitator superfamily (MFS) transporters through heterologous expression in yeast

11/27/2013

Membrane transport proteins can be involved in the uptake of essential nutrients or in the efflux of toxic compounds. In the present work we have used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a heterologous expression system to gain insights into the role of three Arabidopsis thaliana putative major facilitator superfamily transporters encoded by the open reading frames MFS10, MFS11 and MFS12, through their cloning into the plasmid pGREG576 and functional expression in yeast. The expression of MFS12 fused to the GFP gene in yeast localized the encoded transporter at the endoplasmic reticulum and plasma membranes. Its expression conferred increased susceptibility to Cs+ and Cu2+ and increased tolerance to Mn2+ and acetic acid. Yeast cells expressing the MFS10 or MFS11 showed fluorescent dots throughout the cytosol and increased susceptibility to Cs+ and resistance to Mn2+ and acetic acid. In addition, MFS10 expression also led to increased susceptibility to Al3+, Co2+ and Cu2+. The alternative use of the plasmid pGREG596, with a plasma membrane localization signal, was attempted to allow the localization of MFS10- and MFS11-GFP-fused proteins at plasma membrane, but protein localization was not uniformly distributed in the plasma membrane. Under these conditions, the expression of each gene led to increased susceptibility to Cs2+ and resistance to acetic acid. All together, results indicate that these phenotypes are of interest to be tested in the corresponding A. thaliana knock-out mutants or overexpression lines and to guide further studies to understand the biological function of these plant genes. A aquisição de nutrientes ou a expulsão de compostos tóxicos da célula são processos biológicos mediados por proteínas transmembranares. O presente trabalho envolveu o estudo de três presumíveis transportadores codificados pelas grelhas de leitura aberta MFS10, MFS11 e MFS12 pertencentes à planta modelo Arabidopsis thaliana e incluídos na Superfamília de Facilitadores Principais. O modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae foi utilizado como sistema de expressão heteróloga para a análise funcional do papel destes transportadores. Os três genes foram clonados no vetor de clonagem pGREG576 e expressos em levedura. A expressão em levedura do gene MFS12 fundido com o gene GFP mostrou que a respetiva proteína está localizada nas membranas do retículo endoplasmático e plasmática e a sua expressão conduz ao aumento da suscetibilidade ao Cs+ e Cu+ e da tolerância ao Mn2+ e ácido acético. Os genes MFS10 e MFS11 quando expressos levaram a agregados fluorescentes no citosol e a um aumento da suscetibilidade ao Cs+ e tolerância ao Mn2+ e ácido acético. A expressão do gene MFS10 conduziu também a um aumento da suscetibilidade ao Al3+, Co2+ e Cu2+. De modo a garantir uma localização na membrana plasmática dos transportadores MFS10 e MFS11, foi utilizado o plasmídeo pGREG596. No entanto, as respetivas proteínas não mostraram uma localização uniforme em toda a membrana plasmática, embora a sua expressão leva-se também a um aumento da suscetibilidade ao Cs+ e da tolerância ao ácido acético. Em suma, estes resultados indicam que estes dois fenótipos são de interesse para posterior análise em mutantes de A. thaliana e poderão guiar estudos futuros com vista à compreensão da função destes transportadores.

Authors in the community:

• 

  J

  João Miguel Rodrigues da Silva Brazão

  ist172555

Supervisors of this institution:

• 

  I

  Isabel Sá-Correia

  ist11177

202067653

Mestrado em Biotecnologia

industrial-biotechnology - Industrial Biotechnology

Keywords

• Saccharomyces cerevisiae
• Arabidopsis thaliana
• expressão heteróloga
• transportadores MFS
• resistência a ácido acético
• suscetibilidade ao Cs+
• Saccharomyces cerevisiae
• Arabidopsis thaliana
• heterologous expression
• MFS transporters
• resistance to acetic acid
• susceptibility to Cs+

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