Valorisation of pectin-rich agro-industrial residues by yeasts: potential and challenges

Luís Miguel Candeias Martins

Key information

Authors:

Luís Miguel Candeias Martins (Luís Miguel Candeias Martins)

Supervisors:

Isabel Maria De Sá Correia Leite de Almeida (Isabel Sá-Correia)

Published in

05/18/2021

Abstract

A implementação de uma bioeconomia circular com base na conversão eficiente de resíduos agroindustriais por leveduras é um importante desafio social. Os resíduos agroindustriais são uma fonte de carbono baixo valor comercial para o crescimento microbiano, em particular os resíduos ricos em pectina que são gerados em elevadas quantidades mundialmente pela indústria açucareira ou pela indústria processadora de fruta e vegetais. A hidrólise dos resíduos ricos em pectina, principalmente de beterraba sacarina, liberta açúcares neutros (D-glucose, L-arabinose and D-galactose) e um açúcar-ácido (ácido D-galacturónico), e outras potenciais fontes de carbono e inibidoras do metabolismo como sejam o ácido acético e metanol. A levedura Saccharomyces cerevisiae é a mais importante e explorada espécie como fábrica celular para a produção de bioetanol em biorefinarias. Contudo, o interesse em espécies de levedura não-Saccharomyces tem ganho relevância uma vez que este grupo heterogéneo incluiu leveduras com maior versatilidade catabólica e biossintética e maior tolerância a stresses presentes nos bioprocessos. Os desafios encontrados na bioconversão dos hidrolisados ricos em pectina por leveduras incluem a otimização de vias metabólicas envolvidas no catabolismo eficiente de todas fontes de carbono presentes, a biossíntese eficiente de productos com valor acrescentado e no aumento da tolerância a stresses relacionados com o desenvolvimento de bioprocessos. O metanol está presente em hidrolisados de beterraba sacarina, é uma matéria-prima para as leveduras metilotróficas e é a maior impureza no glicerol-bruto, um subproduto da produção de biodiesel e potencial substrato para biorrefinarias. Quando comparado com o etanol, os mecanismos de toxicidade e os determinantes de tolerância ao metanol encontramse muito menos estudados. A análise quimiogenómica realizada nesta dissertação identificou, à escala do genoma, os genes de tolerância cuja expressão é necessária para a máxima tolerância ao metanol e ao etanol. O agrupamento dos genes de tolerância identificados indica um enriquecimento em certas categorias funcionais no conjunto dos resultados para metanol que não se encontram enriquecidos nos de etanol, como sejam: remodelação da cromatina, reparação de DNA e biossíntese de ácidos gordos. Vários genes envolvidos na reparação do DNA (oito genes RAD), foram identificados como específicos para o metanol e anteriormente identificados como determinantes de tolerância para o formaldeído, um intermediário da via de desintoxicação do metanol em levedura. Este estudo é um primeiro passo não só para a compreensão dos mecanismos de toxicidade/tolerância mas também para uma manipulação genómica racional para a obtenção de leveduras mais robustas. Nesta tese foram isoladas e identificadas, ao nível molecular, leveduras de várias espécies da polpa de beterraba sacarina. Entre elas, uma estirpe de Rhodotorula mucilaginosa cujo desempenho foi avaliado e otimizado a par com o de uma outra levedura oleaginosa R. toruloides PYCC 5615, com vista à utilização total das fontes de carbono presentes no hidrolisado de polpa de beterraba sacarina a pH 5.0. Foi estudado o papel do ácido acético como fonte de carbono/energia e inibidor do metabolismo celular. O ácido acético (30 mM a pH 5.0) impediu o catabolismo do ácido D-galacturónico e da L-arabinose após o consumo das outras fontes de carbono. No entanto, a D-glucose e o ácido acético foram metabolizados simultaneamente, a que se seguiu o consumo de D-galactose. A suplementação do hidrolisado de polpa de beterraba sacarina com aminoácidos foi crucial para permitir o catabolismo do D-galacturónico ácido e da L-arabinose mesmo na presença de ácido acético. A valorização da polpa de beterraba sacarina para produção de lípidos e carotenoides por estirpes de Rhodotorula com utilização completa das principais fontes de carbono presentes, parece promissora com vista a implementação industrial. The implementation of a circular bioeconomy based on the efficient bioconversion of agro-industrial residues by selected yeasts is an important societal challenge. Agro-industrial residues are low-cost carbon sources (C-sources) for microbial growth, in particular those rich in pectin, which are generated in high amounts worldwide from the sugar industry or the industrial processing of fruits and vegetables. The hydrolysis of the pectin-rich residues, specifically of sugar beet pulp (SBP), releases neutral sugars (D-glucose, L-arabinose and Dgalactose), an acidic sugar (D-galacturonic acid) and other potential C-sources which are also metabolic inhibitors such as acetic acid and methanol. Although Saccharomyces cerevisiae is the most important and explored yeast cell factory in Yeast Biorefineries for the production of bioethanol, the interest in non-S. cerevisiae yeast species with higher catabolic and biosynthetic versatility and tolerance to bioprocessrelated stresses is gaining momentum. The challenges faced in the bioconversion of pectinrich hydrolysates by yeasts involve the search for optimized metabolic pathways for the catabolism of all the carbon sources present and the efficient biosynthesis of relevant valueadded compounds and high tolerance to bioprocess-related stresses. Methanol is a feedstock for methylotrophic yeasts, is present in SBP hydrolysates, and is a major impurity in crude glycerol, a by-product of biodiesel production. Nevertheless, methanol tolerance determinants and toxicity mechanisms are poorly known compared with ethanol. The chemogenomic analysis performed in this thesis identified tolerance genes whose expression is required for maximum methanol and/or ethanol tolerance. The clustering of the identified tolerance genes indicated an enrichment of functional categories in the methanol dataset not enriched in the ethanol dataset, such as chromatin remodeling, DNA repair and fatty acid biosynthesis. Several genes involved in DNA repair (eight RAD genes), identified as specific for methanol toxicity, were previously reported as tolerance determinants for formaldehyde, a methanol detoxification pathway intermediate. This study is a first step not only for toxicity/tolerance mechanistic insights but also for the rational genomic manipulation of yeasts to obtain more robust strains. In this thesis, it was also isolated from SBP and identified, at the molecular level, several yeast isolates. Among them, Rhodotorula mucilaginosa IST 390 whose performance was examined and optimized, together with the performance of another oleaginous red yeast, R. toruloides PYCC 5615, envisaging the full utilization of the C-sources in SBP hydrolysate (at pH 5.0). The dual role of acetic acid as carbon and energy source and as a growth and metabolism inhibitor was examined. Acetic acid (30 mM at pH 5.0) prevented the catabolism of D-galacturonic acid and L-arabinose after the complete use of the other C-sources. However, D-glucose and acetic acid were simultaneously and efficiently metabolized, followed by Dgalactose. SBP hydrolysate supplementation with amino acids was crucial to allow Dgalacturonic acid and L-arabinose catabolism even in the presence of acetic acid. SBP valorization through the production of lipids and carotenoids by Rhodotorula strains, supported by complete catabolism of the major C-sources present, looks promising for industrial implementation.