Phenylboronic acid as ligand for multimodal chromatography

Rimenys Junior Carvalho

Key information

Authors:

Rimenys Junior Carvalho (Rimenys Junior Carvalho)

Supervisors:

Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros (Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros)

Published in

10/25/2013

Abstract

Desde que a habilidade dos ácidos borónicos de formar ligações covalentes reversas com grupos cis-diol foi divulgada, vários estudos têm sido realizados com o intuito de explorar essa interacção. Entretanto, a interacção cis-diol é uma entre diferentes possíveis interacções do ácido fenilborónico. Esse comportamento multimodal é uma das principais razões pela qual os mecanismos de interacção dessa cromatografia ainda não estão completamente elucidados. Neste contexto estudos de caracterização das interacções entre o ácido fenilborónico e proteínas seleccionadas foram realizados em diferentes condições de adsorção com o objectivo de aperfeiçoar a selectividade dessa cromatografia de afinidade. Estudos de adsorção foram realizados numa faixa de pH entre 4 e 9 e diferenças na retenção das proteínas foram relacionadas com seu pI e presença de glicanos em sua estrutura. Estratégias de eluição foram então aplicados e boa selectividade foi obtida pela separação de glicoproteínas com gradiente de Tris e pela separação de proteínas ácidas/neutras com gradiente de citrato. Imobilizações de ácido fenilborónico em criogéis com grupos funcionais foram realizados em diferentes condições para posterior integração das etapas de clarificação e captura do processo de purificação de anticorpos. Todas as matrizes com fenilboronato mostraram ser capazes de adsorver IgG policlonal, porém selectividade e capacidade precisam ser aprimoradas para uma maior eficiência. Since the ability of boronic acids to form reversible covalent bonds with cis-diol groups was first reported, several studies have been performed to explore this interaction. Due to phenylboronic acid (PBA) multimodal behavior, cis-diol affinity is just one of the possible interactions between PBA and target molecules. This multimodal behavior of PBA is the main reason of miscomprehension of mechanisms of interactions of phenylboronate chromatography. Thus characterization of these additional chemical interactions between PBA and a selected protein library under different conditions was performed aiming the improvement of selectivity of phenylboronate chromatography. Adsorption experiments were carried out over a pH range from 4 to 9 and differences in the retention of these proteins were generally related with, charge (pI value) and presence of glycans. Elution strategies were also applied and a good selectivity was achieved when glycoproteins were separated through tris gradient and acidic/neutral proteins through citrate gradient. Immobilization of PBA, by different conditions, onto cryogels with functional epoxy group was also evaluated for further integration of the clarification and capture steps of the downstream process of antibodies. All phenylboronate matrices tested were able to capture polyclonal IgG, however selectivity and capacity of the process has still to be improved.