Tese de Doutoramento
Yeast adaptive response and tolerance to acetic acid stress: focus on the cell envelope
2022
—Informações chave
Autores:
Orientadores:
Publicado em
12/10/2022
Resumo
A levedura Saccharomyces cerevisiae é um modelo experimental eucariótico e uma fábrica celular, sendo uma plataforma experimental de inestimável interesse para o estudo dos mecanismos subjacentes à resposta adaptativa e à tolerância a stresses de relevo em bioprocessos industriais. Adicionalmente, a implementação de uma bioeconomia circular sustentável exige o desenvolvimento de biorefinarias avançadas com base em leveduras para produzir biocombustíveis e outros bioprodutos a partir de resíduos orgânicos. Nesta transição para uma bioeconomia sustentável, algumas leveduras não-Saccharomyces estão a ganhar relevância devido à sua elevada versatilidade catabólica e biossintética e à elevada tolerância a stresses de relevo em bioprocessos industriais. O ácido acético é um inibidor de elevado impacto em bioprocessos industriais, é amplamente utilizado como conservante de alimentos e bebidas e é também um subproduto da fermentação alcoólica que, em conjunto com elevadas concentrações de etanol e outros metabolitos tóxicos, contribui para a inibição ou paragem das fermentações. Entre os mecanismos propostos como subjacentes à adaptação e tolerância a este stress, destaca-se a alteração das propriedades da parede celular. A compreensão destes mecanismos moleculares é essencial para guiar a construção racional de leveduras no sentido de desenvolver estirpes com maior robustez face às múltiplas agressões a que estão expostas durante os bioprocessos industriais, de modo a garantir a sua máxima produtividade e viabilidade económica dos bioprocessos. As condições de stress desencadeiam respostas celulares complexas e, entre elas, as que envolvem a remodelação da parede celular, cujas propriedades bioquímicas e biofísicas podem ser moduladas para melhor perceção, resposta e adaptação ao stress. O objetivo do trabalho desenvolvido durante esta tese de doutoramento foi o de examinar o papel da parede celular, as suas propriedades físico-químicas e as vias de sinalização relacionadas com a sua biossíntese e regulação, durante as diferentes fases da resposta adaptativa de uma população celular de S. cerevisiae, subitamente sujeita a stress induzido por ácido acético. Uma vez que existem indicativos de que alterações que ocorrem ao nível da composição da membrana plasmática e das propriedades biofísicas podem suscitar respostas ao nível da parede celular, a hipótese de uma resposta coordenada entre a membrana plasmática e a parede celular foi examinada. Para o efeito, o conteúdo de ergosterol foi alterado através da expressão do transportador de ergosterol Pdr18, presente na membrana plasmática e pertencente à superfamília ABC, e um determinante de tolerância a ácido acético e outros stresses. Foram caracterizadas as propriedades moleculares e biofísicas da parede celular durante as diferentes fases de adaptação e crescimento sujeito a stress induzido por ácido acético na estirpe parental e no mutante de eliminação pdr18Δ. Durante o estudo, observou-se um aumento da resistência da parede celular à atividade de liticase durante o período de latência de crescimento induzida por ácido acético. Esta alteração foi correlacionada com o aumento da rigidez da parede celular (avaliado por AFM), o aumento do conteúdo da parede celular em β-glucanos (avaliado por microscopia de fluorescência) e o ligeiro aumento dos níveis de transcritos do gene GAS1, que codifica uma β-1,3-glucanosiltransferase envolvida no alongamento das cadeias de β1,3- glucanos. Este resultado reforça a ideia de que a resposta adaptativa de levedura ao stress induzido por ácido acético envolve uma alteração coordenada da parede celular a nível biofísico e molecular, essencial para limitar o ciclo fútil associado à reentrada da forma tóxica do ácido após a expulsão ativa do contra-ião acetato do interior da célula. Foi ainda demonstrada a existência de uma “conversa cruzada” entre o conteúdo de ergosterol da membrana plasmática e as propriedades biofísicas da parede celular. Apesar da resposta adaptativa robusta e mais intensa observada em células do mutante com o gene PDR18 eliminado, envolvendo a ativação transcricional dos genes biossintéticos de parede celular induzida por ácido acético e aumento da rigidez da parede celular, a resistência da parede celular à liticase do mutante de eliminação pdr18Δ revelou-se inferior à da estirpe parental. Acresce que a duração do período necessário para a recuperação do pH intracelular para valores mais fisiológicos e para a retoma do crescimento foi superior no caso da população menos tolerante de células pdr18Δ. Coletivamente, os resultados do trabalho desenvolvido durante esta tese fornecem uma visão integrada do papel da parede celular na adaptação e tolerância ao stress induzido por ácido acético, e da importância da composição lipídica da membrana celular na homeostase da parede celular durante esse stress. The experimental eukaryotic model and cell factory Saccharomyces cerevisiae is an invaluable platform to study the mechanisms underlying yeast adaptive response, and tolerance to stresses that occur in industrial-relevant bioprocesses. The implementation of a circular bioeconomy demands the development of Advanced Yeast Biorefineries to produce biofuels or other bioproducts from organic residues. In this transition to a sustainable biobased economy, some non-Saccharomyces yeast species are gaining attention due to their high catabolic and biosynthetic versatility and tolerance to relevant bioprocess-related stresses. Acetic acid is a major inhibitory compound in industrial bioprocesses, it is widely used as a preservative in food and beverages and is also a byproduct of alcoholic fermentation, that, together with high concentrations of ethanol and other toxic metabolites, leads to fermentation inhibition or arrest. Among the proposed mechanisms underlying adaptation and tolerance to this stress, is the alteration of the properties of the cell wall. The understanding of the molecular mechanisms underlying yeast adaptive response and tolerance to stress is essential to guide the genetic engineering of yeasts to develop more robust strains capable to cope with the challenging conditions to which they are exposed during industrial bioprocesses to guarantee their efficient growth and productivity and assure their economic viability. Stressing conditions trigger intricate cellular responses and, among them, are those involving cell wall remodeling, whose biochemical and biophysical properties can be tuned in order to better sense, respond and adapt to stress. The objective of this thesis work was to examine the role of the cell wall, its physico-chemical properties and cell-wall-biosynthesis and regulation-related signalling pathways during the different phases of the adaptive response of a cell population of S. cerevisiae to sudden exposure to acetic acid stress. Given the existing indications that alterations at the level of plasma membrane composition and biophysical properties can result in responses at the level of cell wall, the hypothesized crosstalk between plasma membrane and the cell wall was examined. For this, the ergosterol content was altered by altering the expression of the plasma membrane transporter ABC transporter Pdr18 involved in ergosterol transport and a determinant of tolerance to acetic acid and other stresses. The cell wall molecular and biophysical properties were characterized in the parental strain and in the deletion mutant pdr18Δ during the different phases of adaptation and growth under acetic acid stress. An increase of the cell wall resistance to lyticase activity of the parental strain was observed during acetic acidinduced growth latency. This alteration was correlated with the increase of cell wall stiffness (assessed by AFM) , the increase of the content of cell wall β-glucans (assessed by fluorescence microscopy) and the slight increase of the transcript levels from the GAS1 gene, encoding a β-1,3-glucanosyltransferase involved in elongation of β1,3- glucans chains. This result reinforces the notion that the adaptive yeast response to acetic acid stress involves a coordinate alteration of the cell wall at both biophysical and molecular levels, essential to limit the futile cycle associated to the re-entry of the toxic acid form after the active expulsion of acetate from the cell interior. A crosstalk between plasma membrane ergosterol content and cell wall biophysical properties was also demonstrated. However, despite the robust and more intense adaptive response registered in cells devoid of PDR18, involving the acetic acid-induced transcriptional activation of cell wall biosynthetic genes and an increased cell wall stiffness, the cell wall resistance to lyticase of the pdr18Δ mutant was below the one registered for the parental strain. Moreover, the duration of the period required for intracellular pH recovery to more physiological values and growth resumption was higher for the less tolerant pdr18Δ population. Collectively, the results from this thesis work provide an integrative view on the role of the cell wall in adaptation and tolerance to acetic acid stress, and on the importance of membrane lipid composition in cell wall homeostasis during stress.
Detalhes da publicação
Autores da comunidade :
Ricardo Aguilar Andrade Ribeiro
ist423249
Orientadores desta instituição:
Isabel Sá-Correia
ist11177
RENATES TID
101713231
Designação
Dotoramento em Biotecnologia e Biociências
Domínio Científico (FOS)
- Ciências Biológicas
Palavras-chave
- adaptative response to acetic acid
- tolerance to acetic acid
- cell envelope
- cell wall
- resposta adaptativa ao ácido acético
- tolerância ao ácido acético
- envelope celular
- parede celular
Idioma da publicação (código ISO)
- Inglês
Acesso à publicação:
Acesso Aberto
Nome da instituição
Instituto Superior Técnico
Entidade financiadora da bolsa/projeto
Fundação para a Ciência e a Tecnologia