Probing the structural plasticity of the potassium channel KcsA using homo-FRET methodologies

15/03/2022

Os canais de potássio são proteínas de membrana (MPs) ubiquamente distribuídas por vários organismos procariotas e eucariotas, desempenhando um papel fundamental na regulação da excitabilidade celular. O mau funcionamento destas MPs está na origem de várias doenças humanas (canalopatias), pelo que estes canais têm sido um alvo intenso de investigação na área das Ciências da Vida. O KcsA isolado de Streptomyces lividans é um canal de potássio protótipo que tem sido usado para responder a algumas das questões persistentes sobre esta família de proteínas, incluindo a sua seletividade em relação ao K+ e a inativação do tipo C, devido à sua homologia elevada com os seus homólogos eucariotas. Este estudo focou-se no uso de dois sensores independentes baseados na ocorrência de homotransferência de energia de ressonância de Förster (homo-FRET) para caracterizar os rearranjos estruturais das gates externa e interna do KcsA, bem como a sua comunicação alostérea bidirecional, através da realização de medidas de anisotropia de fluorescência em estado estacionário e resolvidas no tempo. O sensor da gate externa, formado pelos resíduos W67 num mutante contendo um único resíduo de triptofano, W67 KcsA, permitiu seguir as mudanças conformacionais das hélices do poro associadas à ocupação progressiva do filtro de seletividade (SF) por diversos catiões e bloqueadores do canal, nos seus estados fechado (pH 7.0) e aberto (pH 4.0). Notavelmente, foi possível determinar distâncias laterais W67-W67 com resolução de Å usando uma solução analítica que descreve o processo do homo-FRET numa geometria quadrada correspondente ao canal tetramérico; estes estudos forneceram informação estrutural complementar à obtida por outras técnicas biofísicas mas agora sob condições experimentais suaves. Por sua vez, o sensor da gate interna baseou-se na conjugação da sonda tetrametilrodamina (TMR) na mutação G116C introduzida no âmbito do W67 KcsA. Este sensor foi usado para caracterizar a ativação do KcsA e as suas repercussões sobre o SF - a migração de energia entre as sondas TMR conjugadas diminuiu após abertura da gate interna induzido pela acidificação do meio, provocando um aumento concomitante na sua anisotropia de fluorescência. O estudo deste sistema com dois sensores independentes baseados em homo-FRET (W67/gate externa e TMR/gate interna) confirmou o importante papel desempenhado pelo centro de ligação S2 na comunicação alostérea entre a gate de ativação e o SF do KcsA. K+ channels are integral membrane proteins (MPs) broadly distributed among prokaryotic and eukaryotic organisms that play an essential role in regulating cellular excitability. Dysfunction of these MPs can lead to several diseases (channelopathies), and therefore K+ channels have become an active research field in Life Sciences. KcsA from Streptomyces lividans is a prototypical K+ channel that has been used to answer some of the long‐standing questions about this family of proteins, including K+ selectivity and C‐type inactivation, due to its high homology to its eukaryotic counterparts. This work focused on using two independent homo-Förster resonance energy transfer (FRET) based sensors to characterize the structural rearrangements of the outer and inner gates of KcsA, and their bidirectional allosteric communication, through the performance of steady-state and time-resolved fluorescence anisotropy measurements. The outer gate sensor, formed by the W67 residues in the single tryptophan mutant W67 KcsA, allowed monitoring the conformational changes of its pore helices linked to the progressive occupation of the selectivity filter (SF) by several cations and channel blockers, in both its closed (pH 7.0) and open (pH 4.0) states. Notably, an analytical solution describing the homo-FRET process within the square geometry of the tetrameric channel enabled the determination of W67-W67 lateral distances with Å resolution under mild experimental conditions, thereby complementing the structural information gathered by other biophysical techniques. In turn, the inner gate sensor consisted in conjugating the tetramethylrhodamine (TMR) dye to the G116C mutation introduced within the background of W67 KcsA. This sensor was used to characterize the activation of KcsA and its repercussions over the SF - energy migration among the TMR conjugated dyes decreased upon the pH-induced inner gating opening, eliciting a concomitant increase in the fluorescence anisotropy of TMR. The study of this homo-FRET based double sensor system (W67/outer gate and TMR/inner gate) confirmed the important role played by the S2 binding site on the allosteric cross-talk between the activation gate and the SF of KcsA.

Autores da comunidade :

• 

  C

  Clara Díaz García

  ist191515

Orientadores desta instituição:

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  A

  Ana Isabel Abrantes Coutinho

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• 

  M

  Manuel José Estevez Prieto

  ist10881

• 

  M

  Maria Lourdes Renart Pérez

  ist423056

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Doutoramento em Química

chemical-sciences - Química

Palavras-chave

• Canais iónicos
• Alteração conformacional
• Inativação do tipo C
• Transferência de energia de ressonância de Förster
• Anisotropia de fluorescência
• Ion channels
• Conformational change
• C-type inactivation
• Förster resonance energy transfer
• Fluorescence anisotropy

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Instituto Superior Técnico