Fluorescently-labeled DNA probes functionalized onto gold nanorods for signal enhancement of nucleic acids’ detection

David José Roxo Botequim

Key information

Authors:

David José Roxo Botequim (David José Roxo Botequim)

Supervisors:

Pedro Miguel Neves Ribeiro Paulo (Pedro Miguel Neves Ribeiro Paulo); Duarte Miguel de França Teixeira dos Prazeres (Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres)

Published in

11/18/2020

Abstract

Os biosensores são ferramentas fundamentais em várias áreas da nossa sociedade contemporânea, incluindo na medicina e nos cuidados de saúde, sendo úteis em diagnóstico e em terapêutica ao providenciarem a deteção de biomarcadores associados a doenças. Em particular, a área da nanomedicina, na qual a nanotecnologia é aplicada à biotecnologia e à medicina, poderá contribuir para o desenvolvimento de biosensores inovadores que num futuro próximo virão a colmatar a necessidade de testes de diagnóstico para análises no ponto de atendimento (ou POC do acrónimo em inglês). Esta abordagem representará uma melhoria significativa nos cuidados de saúde prestados à generalidade da população. Foi neste contexto científico e tecnológico que a presente tese de doutoramento foi desenvolvida. É assim dada uma contribuição para este esforço coletivo na área de nanobiosensores através da investigação de sondas fluorescentes de DNA conjugadas com nanopartículas de ouro. Estes sensores nanohíbridos foram idealizados para melhorar a deteção de ácidos nucleicos propostos na literatura como biomarcadores associados a doenças. A sinalização por fluorescência é baseada em sondas artificiais de DNA em gancho (ou hairpin) conhecidas como faróis moleculares (molecular beacons). A função da partícula metálica, por sua vez, extravasa a de uma simples plataforma à nano-escala, dado que esta pode atuar como antena ótica e induzir intensificações elevadas na emissão do corante fluorescente. O trabalho de investigação foi dedicado principalmente à avaliação da intensificação da emissão de sondas fluorescentes de DNA pelo efeito antena das nanopartículas de ouro, de modo a alcançar a amplificação do sinal ótico em sensores baseados na fluorescência. Estudos detalhados do efeito de intensificação foram realizados por microscopia confocal de fluorescência com sensibilidade para molécula individual e em combinação com espectroscopia de partícula única. As experiências revelaram intensificações máximas de duas e três ordens de grandeza para a emissão de corantes fluorescentes na gama do vermelho induzidas, respetivamente, por um nanobastonete de ouro ou, em alternativa, por um dímero de nanoesferas de ouro. Posteriormente, foi otimizada a funcionalização da superfície de nanobastonetes de ouro através da validação de um método para colocar sondas fluorescentes de DNA especificamente nas extremidades de nanobastonetes. Isto assegurou uma intensificação efetiva da emissão dos nanohíbridos em cerca de uma ordem de grandeza, enquanto o revestimento indiscriminado da superfície levou a uma indesejada supressão da emissão, tal como medido num volume macroscópico por técnicas de espectroscopia de fluorescência em estado estacionário. Biosensors are fundamental tools in several areas of our contemporary society, including medicine and healthcare, being useful in diagnostics and therapeutics, as they provide the detection of disease biomarkers. In particular, the field of nanomedicine, in which nanotechnology is applied to biotechnology and medicine, may contribute to the development of innovative biosensors that in a near future will fulfill the demand for diagnostic tests towards point-of-care testing. This will create significant solutions and improvements upon the general public healthcare. The present doctoral thesis was developed in this scientific and technological context. Thus, a contribution is given toward this collective effort in the field of nanobiosensors with research studies on fluorescently-labeled DNA probes conjugated onto gold nanoparticles. These nanohybrid sensors were envisioned for improved detection of nucleic acids proposed in the literature as disease biomarkers. The fluorescence signalling is based on artificial DNA hairpin probes known as molecular beacons, and the role of the metal particle is more than that of a nano-scaled platform, as it can act as an optical antenna and induce large enhancements in the dye’s emission. The research work was mostly dedicated to the evaluation of the emission enhancement of dye-labeled DNA probes by the antenna effect of the gold nanoparticles, in order to achieve amplification of the optical signal in fluorescence-based sensors. Detailed studies of the enhancement effect were performed by confocal fluorescence microscopy with single-molecule sensitivity and combined with single-particle spectroscopy. The experiments afforded top enhancements of two and three orders of magnitude for the emission of red-emitting dyes, induced, respectively, by one gold nanorod or, alternatively, by one dimer of gold nanospheres. Afterward, the surface functionalization of gold nanorods was optimized through the validation of a method for loading dye-labeled DNAs specifically onto the nanorods’ tips. This ensured effective emission enhancement in the nanohybrids of about one order of magnitude, while indiscriminate surface coating led to undesired emission quenching, as measured in a macroscopic volume by steady-state fluorescence spectroscopy. For the creation of the nanohybrid sensors, various model systems based on molecular beacons were explored and tested in conjugation with gold nanorods. The molecular beacons were designed to function based on a variation on the efficiency of the resonance energy transfer process by the Förster mechanism (FRET) prompted by changes in the hairpin conformation. The selected donor-acceptor pair consisted of the dye Atto-647N and the quencher molecules DDQ II and QSY 21. Preliminary assays were performed with synthetic RNA and DNA targets, whose sequences were proposed in the literature for medical diagnostics of infectious diseases.