Exploiting altered metabolism for cancer treatment: in search for novel hexokinase 2 inhibitors

Sara Cristina Nobre Garcia

Informações chave

Autores:

Sara Cristina Nobre Garcia (Sara Cristina Nobre Garcia)

Orientadores:

Maria Matilde Soares Duarte Marques (Maria Matilde Soares Duarte Marques); Rita Alexandra do Nascimento Cardoso Guedes

Publicado em

14/03/2022

Resumo

A alteração da via glicolítica é uma característica reconhecida nas células cancerígenas. O aumento da glicólise , e a sua modulação representa assim uma oportunidade no tratamento do cancro. Várias enzimas estão sobreexpressas na via glicolítica de diferentes tipos de células cancerígenas, nomeadamente a hexocinase 2 (HK2). Curiosamente, esta enzima não está apenas envolvida no primeiro, e mais decisivo, passo da glicólise, e consequentemente em outras subvias do metabolismo central, mas também na imortalização das células cancerígenas. Quando a HK2 se encontra cataliticamente ativa, é capaz de interagir com a membrana mitocondrial externa (MOM), prevenindo a normal sinalização pro-apoptótica. O bloqueio desta interação promove a ligação de proteínas pro-apoptóticas à MOM, estimulando a apoptose nas células cancerígenas. Assim, a inibição da HK2 é proposta como uma estratégia para reduzir a maior fonte de energia das células cancerígenas, diminuindo a proliferação celular e promovendo a apoptose. Com o objetivo de encontrar compostos “hit” capazes de interferir com a atividade catalítica da HK2, foi implementada uma estratégia multidisciplinar que envolveu um rastreio virtual baseado na estrutura (SBVS) e a sua validação que incluiu estudos in silico, síntese orgânica e uma componente de caracterização química, bioquímica e biológica dos compostos obtidos. Após a preparação do protocolo de SBVS usando como método o docking molecular implementado no programa GOLD V.5.2, foram rastreadas várias bibliotecas de compostos virtuais tais como DrugBank, NCI (National Cancer Institute) e InterBioScreen (natural products database). Deste processo resultaram 2981 moléculas que foram consideradas potenciais inibidoras da HK2. Estas moléculas foram ainda filtradas com base na previsão das suas propriedades druglike. O protocolo foi validado experimentalmente através de um ensaio bioquímico, utilizando-se 64 das moléculas selecionadas (10 µM) e a enzima HK2. Os resultados demonstraram que todos os compostos afetaram a atividade da HK2. Destes, 22 compostos evidenciaram ter capacidade para inibir a HK2 na mesma extensão ou mais proeminentemente que o inibidor conhecido 3-bromopiruvato. Deste modo, comprovou-se que o protocolo de SBVS utilizado é capaz de identificar moléculas bioativas cujas estruturas poderão ser otimizadas e/ou submetidas a testes mais elaborados. Neste projeto foi utilizada a síntese orgânica como ferramenta para a obtenção de um inibidor conhecido e de uma família de potenciais inibidores. De acordo com o conhecimento obtido a priori relativamente à sensibilidade de vários tipos de linhas celulares à inibição/eliminação da HK2, foi avaliado um conjunto de 62 moléculas selecionadas pelo seu potencial efeito na inibição da proliferação celular de células do carcinoma hepatocelular. As oito moléculas com maior potencial foram avaliadas como inibidores da proliferação de outras linhas celulares, tendo também sido testado o seu efeito na glicólise destas células, paralelamente com dois inibidores da HK2 conhecidos. Foram utilizadas células CHO modificadas para a expressão seletiva da HK1, HK2 ou HK4 para determinar a seletividade de quatro dos inibidores da glicólise descobertos neste estudo. Os quatro compostos inibiram a glicólise a 10 µM em todos os tipos de células CHO testados. Contudo, resultados preliminares mostraram que um destes compostos é capaz de inibir com elevada seletividade, a uma concentração mais reduzida (1.5 µM), as células CHO que expressam especificamente a isozima HK2. Embora sejam necessários mais estudos para confirmar o potencial desta molécula, estes resultados encorajam a consideração da HK2 como alvo em futuras campanhas de descoberta de fármacos contra o cancro. Altered central metabolism is a well-established hallmark of cancer cells. The glycolytic pathway has been demonstrated to be consistently increased in these cells, representing a pool of opportunities to be explored for cancer treatment. Several enzymes involved in glycolysis are overexpressed in different types of cancer cells, namely hexokinase 2 (HK2). This enzyme is not only involved in the first and most determinant step of glycolysis, and subsequently in the different branched pathways, but also in the immortalization of cancer cells. When catalytically active, HK2 is able to bind to the mitochondrial outer membrane (MOM), preventing the normal pro-apoptotic signaling. The disruption of this interaction promotes the binding of pro-apoptotic proteins to MOM, stimulating the enhancement of apoptosis in cancer cells. The inhibition of HK2 is proposed as a strategy to reduce the main source of energy to cancer cells, thus significantly decreasing cancer cell proliferation and increasing apoptosis. As an effort to find hit compounds able to interfere with the HK2 catalytic activity, a multidisciplinary strategy that involved a structure-based virtual screening (SBVS) campaign and its validation was implemented. This effort included in silico studies and organic synthesis, complemented with chemical, biochemical and biological characterization of the molecules. After the design of the SBVS protocol using molecular docking calculations with GOLD 5.2 software, several virtual compound libraries such as DrugBank, NCI and InterBioScreen Natural Products were screened. As result, 2981 molecules with the potential to act as new HK2 inhibitors were identified. After filtering those molecules according to the prediction of drug-like properties, biochemical validation of the aforementioned protocol was conducted using 64 selected molecules at 10 µM against HK2. Preliminary results showed that all test molecules affected HK2 activity to some extent. Twenty-two molecules were found to inhibit the HK2 activity more prominently or in the same range as the known inhibitor 3-bromopyruvate (3BP). Thus, the experimental data supported the predictions of the SBVS procedure, which is able recognize bioactive molecules, ready for structural optimization and/or further testing. Synthetic chemistry was used as tool to synthesize a potent known inhibitor to compare the activity of the newly developed compounds. Additionally, another family of potential HK2 inhibitors found on the SBVS was synthesized. Based on earlier knowledge regarding the sensitivity of several cell lines to HK2 inhibition/ablation, a set of 62 previously selected molecules were firstly evaluated as potential proliferation inhibitors of hepatocellular carcinoma cells. The best eight molecules were then evaluated as proliferation inhibitors of other cell lines and their impact on glycolysis was measured, along with that of two known HK2 inhibitors. Engineered CHO cells overexpressing HK1, HK2 or HK4 were used to determine the isozyme selectivity of four glycolytic inhibitors found in this work. All compounds were able to inhibit glycolysis at 10 µM in all tested CHO cell lines. However, selective inhibition of HK2-expressing cells was preliminarily observed for one of the compounds at a lower concentration (1.5 µM). While further studies are required to confirm the potential of this molecule, these results support consideration of HK2 as a target in future cancer drug discovery campaigns.