Engineering characterisation of bioreactors for human pluripotent stem cell expansion and cardiac differentiation

Diogo do Espírito Santo Nogueira

Key information

Authors:

Diogo do Espírito Santo Nogueira (Diogo do Espírito Santo Nogueira)

Supervisors:

Carlos André Vitorino Rodrigues (Carlos André Vitorino Rodrigues); Joaquim Manuel Sampaio Cabral (Joaquim Manuel Sampaio Cabral)

Published in

07/08/2021

Abstract

As doenças cardiovasculares (CVDs) limitam a qualidade de vida dos pacientes e são responsáveis por milhões de mortes todos os anos. Embora os tratamentos possam mitigar alguns sintomas e proteger o coração após enfarte do miocárdio, a morte de cardiomiócitos é, até ao momento, irreparável devido à sua limitada capacidade de proliferação. As células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) têm a capacidade de se auto-renovarem e de se diferenciarem em todos os tipos de células do corpo humano, e podem ser reprogramadas a partir das células dos próprios pacientes. Portanto, as hiPSCs poderão potencialmente ser aplicadas no desenvolvimento de tratamentos inovadores para uma miríade de CVDs. Com este intuito, metodologias para a sua expansão e diferenciação cardíaca de forma escalonável e robusta terão que ser desenvolvidas. Os biorreatores Vertical-Wheel (VWBRs), descartáveis, têm um inovador e gentil sistema de agitação, e encontram-se disponíveis às escalas de laboratório e de produção. Assim sendo, têm potencial para serem aplicados na biomanufatura à escala clínica de cardiomiócitos derivados de hiPSCs. O âmbito desta tese foi o desenvolvimento de um protocolo integrado para expansão e diferenciação cardíaca de hiPSCs enquanto agregados em VWBRs de 100 mL, bem como a caracterização destes reatores em termos de transferência de massa de oxigénio. Inicialmente, foi testada a expansão sob várias condições, nomeadamente em termos de estratégias de alimentação – descontínua repetida (repeated batch) e semi-contínua – e suplementação com sulfato de dextrano (DS). Nas condições ótimas (alimentação descontínua repetida e suplementação com DS), foi atingida uma densidade celular máxima de (2,3 ± 0,2) × 106 células∙mL–1 em 5 dias, representando um aumento de 9,3 ± 0,6 vezes face ao inóculo. Após a otimização da etapa de expansão, e com base em estudos prévios, as condições foram ajustadas com o intuito de maximizar a diferenciação cardíaca. A utilização de uma estratégia de controlo contínuo da via de sinalização WNT levou à obtenção de um máximo de 73,3% de cardiomiócitos após 15 dias de diferenciação. De forma a prever o efeito do aumento de escala na cultura, nomeadamente no que respeita à agitação e à transferência de massa de oxigénio, um modelo de dinâmica de fluidos computacional foi desenvolvido e validado com dados experimentais. Este modelo pôde prever o perfil de agitação no interior do VWBR de 100 mL, assim como o coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa) do sistema a diferentes velocidades de agitação. Os resultados obtidos demonstram que o VWBR pode sustentar a expansão e diferenciação cardíaca de hiPSCs enquanto agregados. Embora seja necessário realizar estudos e otimizações mais extensos, este sistema revelou-se promissor para a biomanufatura de cardiomiócitos derivados de hiPSCs sob Boas Práticas de Fabrico para o desenvolvimento de terapias cardíacas baseadas em hiPSCs, assim como para aplicações farmacológicas. Cardiovascular diseases (CVDs) impair the quality of life of patients and are responsible for millions of deaths every year. While treatments can already mitigate some symptoms and protect the heart following myocardial infarction, the death of cardiomyocytes is so far irreparable due to their limited proliferation. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can self-renew and differentiate into all cell types of the human body, and they can be reprogrammed from the patients’ cells. As such, hiPSCs can potentially be applied for the development of novel treatments for a myriad of CVDs. For that purpose, methods for their scalable and robust expansion and cardiac differentiation must be developed. The single-use Vertical-Wheel bioreactors (VWBRs) apply a novel and gentle agitation mechanism and are available at laboratory and production scales. As such, they have the potential to be applied for clinicalscale biomanufacturing of hiPSC-derived cardiomyocytes. This thesis aimed at developing a protocol for integrated expansion and cardiac differentiation of hiPSCs as aggregates in 100 mL VWBRs, as well as characterising these bioreactors in terms of oxygen mass transfer. Initially, the expansion under various different conditions was tested, namely in terms of different feeding strategies—repeated batch and fed-batch—and dextran sulfate (DS) supplementation. In optimal conditions (repeated batch and DS supplementation), a maximum cell density of (2.3 ± 0.2) × 106 cells∙mL–1 was achieved in 5 days, representing a 9.3 ± 0.6–fold increase relatively to the inoculum. Following the optimisation of the expansion stage, and based on previous reports, the conditions were adjusted to maximise the cardiac differentiation. By applying continuous control of WNT signalling, a maximum 73.3% cardiomyocytes could be obtained following 15 days of differentiation. In order to predict the effect of larger scales on the culture, namely in terms of agitation and oxygen mass transfer, a computational fluid dynamics model was developed and validated with experimental data. This model predicted the mixing profile inside the 100 mL VWBR, as well as the volumetric mass transfer coefficient (kLa) of the system at different agitation velocities. The results obtained show that the VWBR can sustain aggregate expansion and cardiac differentiation of hiPSCs. Although more extensive studies and optimisation are required, this system shows promise for the biomanufacturing of hiPSC-derived cardiomyocytes under Good Manufacturing Practices for the development of hiPSC-based cardiac therapies, or for pharmacological applications.