Modelling reett syndrome with human patient-specific forebrain organoids

11/02/2021

O cérebro humano é considerado um dos órgãos mais complexos e de difícil acessibilidade do corpo humano, o que dificulta o estudo e a compreensão de processos relacionados com o seu desenvolvimento, assim como de doenças associadas. No entanto, o desenvolvimento da tecnologia das células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) tornou possível gerar e caracterizar diversos tipos de células e tecidos neurais in vitro, semelhantes às observadas no cérebro humano. Consequentemente, estes modelos celulares têm permitido recapitular programas intrínsecos ao desenvolvimento do cérebro humano, assim como características moleculares e fisiológicas inerentes a doenças do neurodesenvolvimento. Neste contexto, o trabalho desenvolvido durante esta tese de doutoramento dividiu-se em dois objectivos principais e independentes, mas complementares, ambos tirando partido do uso de células hiPSCs para gerar modelos neurais. O primeiro estudo desenvolvido foi focado no processo de indução neural, recorrendo à estratégia de inibição dupla da via SMAD, partindo de células hiPSCs cultivadas num sistema 2D. O principal objectivo deste estudo deteve-se na análise e caracterização de potenciais genes, mecanismos moleculares e vias de sinalização determinantes no processo inicial do desenvolvimento neural humano. Recorrendo a uma análise global de transcriptómica foi possível verificar a existência de padrões de expressão genética distintos aquando da formação de diferentes populações neurais, desde as células estaminais neurais proliferativas, passando por progenitores neurais até à formação de rosetas neurais. Adicionalmente, os dados obtidos através da análise transcriptómica foram comparados com dados publicados em bases de dados, tendo-se identificado os genes RFX4 e NR4A3, com capacidade de codificarem factores de transcrição, como sendo potenciais reguladores relevantes e pouco explorados, durante a formação e especificação do prosencéfalo. Foi possível ainda confirmar o papel relevante da via Wnt não-canónica, em detrimento da via Wnt canónica, que se intensifica até à formação das rosetas neurais. Por último, através da análise global da expressão de genes, foi possível compreender a dinâmica relacionada com a actividade mitocondrial, tendo-se observado que este é um factor determinante no processo de transição proliferação/diferenciação. O segundo estudo foi focado na geração de organóides de regiões específicas do prosencéfalo humano (zona dorsal e zona ventral) também a partir de células hiPSCs. Através do estabelecimento deste modelo mais complexo foi possível recapitular a estrutura laminar observada durante o desenvolvimento do córtex humano, assim como modelar uma doença rara do neurodesenvolvimento, a Síndrome de Rett. Desta forma, foi possível observar um desenvolvimento prematuro da camada cortical, formada por neurónios TBR1 e CTIP, e simultaneamente foi possível observar uma diminuição do número de células proliferativas/progenitores neurais nos organóides da região dorsal originados a partir das células hiPSCs derivadas de uma paciente do sexo feminino, portadora da Síndrome de Rett. Análises funcionais dos níveis de cálcio intracelular e de electrofisiologia revelaram ainda alterações funcionais nos neurónios gerados a partir de células hiPSCs desta paciente. Finalmente, usando uma abordagem de fusão de organóides de ambas as regiões, dorsal e ventral, foi possível observar alterações ao nível da capacidade migratória dos neurónios inibitórios. Globalmente, foi assim possível gerar agregados de células correspondentes à região do prosencéfalo, e assim contribuir para uma melhor compreensão da fisiologia e das alterações moleculares associadas à Síndrome de Rett, possibilitando assim no futuro o desenvolvimento de estudos personalizados, com potencial aplicação para o estudo do efeito de possíveis fármacos ou outras estratégias terapêuticas. Em conclusão, espera-se que o presente trabalho possa contribuir para o conhecimento científico relacionado com o período inicial do desenvolvimento do cérebro humano, focado no padrão de expressão de genes, bem como para facilitar o estudo de mecanismos envolvidos na manifestação do fenótipo associado à Síndrome de Rett e outras doenças do neurodesenvolvimento. The brain is one of the most complex organs in the human body and, due to its limited accessibility, human-specific features of neurodevelopment and disease remain largely unknown. The advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology has opened up new possibilities for generating and characterizing different neural cell types and tissues, which are potentially representative of those in the human brain. These breakthrough platforms are able to follow intrinsic developmental programs, which make them valuable tools for studying human brain development, and to generate physiologically relevant models of neurodevelopmental diseases. In this context, this thesis comprises two main distinct but complementary studies, both relying on the generation of neural cells from hiPSCs, which ultimately intend to contribute for a better knowledge of potential genes, molecular mechanisms and signaling pathways that underly early human neural development and of neurodevelopmental-associated disorders. The first study was performed using neural induction of hiPSCs according to the dual-SMAD protocol in conventional two-dimensional (2D) cell culture systems. A bulk transcriptomic analysis allowed to characterize and identify widespread changes in gene expression during neural stem cells (NSCs) proliferation, neural progenitor cells (NPCs) fate commitment and during neural rosette formation. A comparative study using public transcriptomic datasets allowed the selection of two genes encoding transcription factors (TF), RFX4 and NR4A3, which were identified as potential new regulators of human forebrain determination. Moreover, the potential role of molecular mechanisms underlying neural induction, such as the role of the non-canonical Wnt signaling in neural rosette patterning, in addition with the role of the mitochondrial dynamic program as an intervenient process in neural fate decision through a complex transcriptional regulation, was corroborated. Within the second study, it was employed a three-dimensional (3D) culture system, more specifically hiPSC-derived region-specific forebrain organoids, for modeling a rare neurodevelopmental disorder, Rett Syndrome (RTT). Dorsal and ventral forebrain organoids were established from control and RTT patient-specific hiPSCs and were found to accurately recapitulate the 3D complex architecture of the early developing brain, showing the ability to spatially and temporally self-organize into distinct neuronal layers. By employing these region-specific organoid models, it was observed a premature development of the deep-cortical layer, associated to the formation of TBR1 and CTIP2 neurons, and a lower percentage of neural progenitor/proliferative cells in female RTT dorsal organoids. Moreover, calcium imaging and electrophysiology analysis demonstrated functional defects of these RTT neurons. Additionally, assembly of RTT dorsal and ventral organoids revealed impairments of interneuron’s migration. It was therefore demonstrated that RTT forebrain organoid models can greatly help towards a better understanding of the pathophysiology of RTT in a patient-specific context, and for further testing of potential candidate drugs or other therapeutic strategies for RTT. Overall, by undergoing human-based neurodevelopment in a dish, using distinct hiPSCs-based culture systems, it was possible to provide a better understanding of specific gene expression patterns during early neural developmental stages while contributing towards a better understanding of the pathophysiology of RTT in a patient-specific context.

Authors in the community:

• 

  A

  Ana Rita Carreira Baptista Gomes

  ist173387

Supervisors of this institution:

• 

  M

  Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo

  ist24804

• 

  A

  Ana Maria Ferreira de Sousa Sebastião

  ist406426

101540825

Dotoramento em Bioengenharia

industrial-biotechnology - Industrial Biotechnology

Keywords

• Human induced pluripotent stem (hiPSCs)
• Forebrain development
• 2D neural differentiation of hiPSCs
• Neurodevelopment
• Rett syndrome
• Brain organoids
• Células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs)
• desenvolvimento do prosencéfalo
• diferenciação neural em condições 2D
• neurodesenvolvimento
• Síndrome de Rett
• organóides cerebrais

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