Developing bioprocesses with marine bacteria for sustainable industrial applications

07/26/2022

O objetivo da presente tese é o aperfeiçoamento de técnicas com vista à cultura de células “ainda não cultivadas” em laboratório, e o desenvolvimento de bioprocessos integrados através da aplicação da maquinaria enzimática de bactérias marinhas. O crescimento de bactérias em meios sólidos é ainda uma das melhores formas de estudar e descobrir novas bactérias e metabolitos. As bactérias marinhas podem ser biocatalisadores interessantes para vários processos industriais. Tanto células inteiras como enzimas podem ser usadas para produzir produtos de valor acrescentado, em bioprocessos sustentáveis e ecológicos. Bactérias recolhidas na costa portuguesa foram inicialmente isoladas e crescidas através de técnicas de cultivo em placas de agar. Os resultados mostraram uma máxima eficiência de cultura de 45% em comparação com a enumeração de células por microscopia, e o isolamento de bactérias que não foram detetadas por técnicas moleculares. A dedicação para isolar bactérias recolhidas nos Açores, por métodos dependentes de cultura, resultou na criação de uma biblioteca de isolados com 205 estirpes marinhas. O rastreio da biblioteca de isolados detetou a presença de proteases, inulinases, amilases, lipases/esterases e celulases. Uma estirpe Bacillus subtilis com atividade significativa para hidrolisar inulina foi selecionada para estudos de desenvolvimento de bioprocesso, alcançando 2.2 gaçucares/(gproteína.h) num bioreator agitado. Para acelerar a descoberta de novos biocatalisadores, foi desenvolvido um método de alto rendimento para rastrear bactérias com atividade de transaminação, por captura de imagens ao longo do tempo, usando uma reação colorimétrica e análise de imagem. O sistema permitiu reduzir significativamente o tempo requerido para deteção e quantificação da atividade específica de transaminação. Transaminases são enzimas interessantes para a produção de aminas quirais, que podem ser usadas na produção de compostos para a indústria farmacêutica. Com esse propósito, uma ω-transaminase de uma bactéria marinha foi investigada para a conversão de diferentes cetonas para a respetiva amina quiral. As condições de produção e o desenvolvimento do processo foram estudados para produzir uma amina quiral com um grupo funcional trifluorometilo. Através de uma estratégia de remoção in situ de produto, com um sistema de duas fases aquoso-orgânico, foi possível ultrapassar a inibição pelo produto. Para avaliar a capacidade dos biocatalisadores substituírem processos químicos, foi estudada a conversão de benzaldeído em álcool benzílico utilizando a bactéria Glutamicibacter arilaitensis 232 isolada de uma amostra recolhida nos Açores. O desenvolvimento do bioprocesso para VIII produzir álcool benzílico foi bem-sucedido: um reator continuo com fluxo tipo pistão com células imobilizadas permitiu uma produtividade de 1.16 gálcool benzílico/(gPSC.L.h). Para avaliar a capacidade de células usarem substratos sólidos, a biorremediação de cera de parafina sólida foi estudada usando a bactéria Rhodococcus erythropolis DCL14 como modelo. Após a resolução de vários problemas de transferência de massa, a estirpe DCL14 foi capaz de degradar 866 mg de cera de parafina em 20 mL de meio mineral em 62 h. Os resultados indicam a possibilidade de usar esta bactéria para degradar cera de parafina na indústria petroquímica. Globalmente, esta tese demonstra (i) o uso de métodos dependentes de cultura e de rastreamento de alto rendimento para encontrar biocatalisadores adequados a diferentes aplicações, e (ii) como o desenvolvimento de bioprocessos pode contribuir para futuras soluções industriais sustentáveis. The purpose of the present thesis is the improvement of cultivation techniques of ‘yet-to-becultured’ bacteria, and the development of novel integrative bioprocesses by application of the enzymatic machinery of marine bacteria. The growth of bacteria in solid media is still one of the best options for the study and discovery of new bacteria and metabolites. Marine bacteria could be interesting biocatalysts for several industrial processes. Both whole cells and enzymes may be used to produce high value products, in sustainable and environmentally friendly bioprocesses. Bacteria collected in the Portuguese coast were isolated and grown initially by the spread plating technique on agar plates. The results showed a maximum culture efficiency of 45% in comparison with microscopic enumeration of cells, and the isolation of bacteria not detected by molecular techniques. The dedication to isolate bacteria collected in the Azores, by culture dependent methods, resulted in the establishment of a library of isolates with 205 marine strains. The screening of the cell library detected the presence of proteases, inulinases, amylases, lipases/esterases and cellulases. A Bacillus subtilis strain exhibiting significant activity to hydrolyse inulin was selected for bioprocess development studies, reaching 2.2 gsugars/(gprotein.h) in a stirred bioreactor. To accelerate the discovery of new biocatalysts, a high throughput method for screening bacteria with transaminase activity was developed, by time-lapse imaging using a colourimetric reaction and image analysis. The system reduced significantly the time required for detection and quantification of the specific transaminase activity. Transaminases are interesting enzymes to produce chiral amines, which could be used as building blocks of drugs for the pharmaceutical industry. For that purpose, an omega-transaminase from a marine bacterium was investigated for the conversion of different ketones to the respective chiral amines. The production conditions and process development were studied to produce a chiral amine with a trifluoromethyl group. An in situ product removal approach, using an aqueous organic two-phase system, was able to overcome product inhibition. To evaluate the ability of biocatalysts to replace chemical processes, the conversion of benzaldehyde to benzyl alcohol by the bacterium Glutamicibacter arilaitensis 232, isolated from a sample collected in the Azores, was studied. Bioprocess intensification to produce benzyl alcohol was used with success: a continuous flow reactor packed with immobilized cells enabled a productivity of 1.16 gbenzyl alcohol/(gDCW.L.h). To assess the ability of cells to use solid substrates, the bioremediation of solid paraffin wax was investigated using the enzyme machinery of Rhodococcus erythropolis. After solving several mass-transfer issues, strain DCL14 was able to degrade 866 mg of paraffin wax in 20 mL of VI mineral medium in 62 h. The results indicate the potential to use this bacterium for the degradation of paraffin wax in the petrochemical industry. Overall, this thesis demonstrates (i) the use of culture-dependent and high throughput screening methods to find suitable biocatalysts, and (ii) how bioprocess development may contribute to future sustainable industrial solutions.

Authors in the community:

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  C

  Carlos Júnio Caridade Rodrigues

  ist176643

Supervisors of this institution:

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  C

  Carla da Conceição Caramujo Rocha de Carvalho

  ist30853

101710607

Doutoramento em Biotecnologia e Biociências

biological-sciences - Biological sciences

Keywords

• marine bacteria
• biocatalysis
• high throughput screening
• cultivation
• bioprocess development
• bactérias marinhas
• biocatálise
• rastreamento de alto rendimento
• técnicas de cultivo
• desenvolvimento de bioprocessos

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