Biomanufacturing of DNA-origami nanostructures for bio-imaging

Ana Rita da Silva Santos

Informações chave

Autores:

Ana Rita da Silva Santos (Ana Rita da Silva Santos)

Orientadores:

Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres (Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres); Pedro Miguel Neves Ribeiro Paulo (Pedro Miguel Neves Ribeiro Paulo)

Publicado em

01/03/2023

Resumo

As nanoestruturas de DNA-origami assentam na auto-organização de uma molécula de DNA de cadeia simples (ssDNA) longa (~ 103 -104 bases) (scaffold) numa nanoestrutura alvo com a ajuda de oligonucleótidos curtos (agrafos). Os scaffolds são geralmente purificados por (i) extração do DNA genómico de fago produzido em E. coli, que tem limitações na sequência e levanta questões de segurança quanto à contaminação das culturas seguintes, limitando o potencial de escalabilidade e aplicações desta técnica, ou (ii) por extração de gel de agarose, que é uma técnica trabalhosa, demorada, limitada, não escalável, apresenta baixa recuperação com baixa qualidade e requer equipamentos específicos, tornando-a inadequada para aplicações farmacêuticas ou analíticas. O principal objetivo deste trabalho é melhorar a recuperação e a qualidade dos scaffolds. Primeiramente, um método livre de fagos, infeção reversa em E. coli, foi usado para produzir scaffolds contendo sequências aleatórias recorrendo a um plasmídeo ajudante e partículas de fagemídeo. Este método permitiu a produção de altos títulos de partículas de fagemídeo incapazes de auto-replicação, ultrapassando as preocupações de segurança relacionadas com a produção de fagos. Por outro lado, a produção de scaffolds usando PCR assimétrico (aPCR) também foi explorada. Além de gerar as moléculasssDNA alvo, a reação de aPCR contém DNA de cadeia dupla, dNTPs, excesso de primers e enzimas como contaminantes. Para purificar essas misturas foram testadas duas abordagens: (i) afinidade entre esferas magnéticas funcionalizadas e o ssDNA alvo e (ii) cromatografia de troca aniónica e multimodal como plataforma escalável para a purificação de dez misturas de aPCR. Uma ferramenta de cromatografia analítica baseada em cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa de pares de iões também foi desenvolvida para a quantificação de scaffolds de ssDNA. Finalmente, a aplicabilidade de tetraedros de DNA-origami para bioimagem e como modelo de entrega de drogas foi avaliada por técnicas de espectroscopia e microscopia óticas. DNA-origami nanostructures are emerging as components of nanomachines, nanopores, drug delivery systems and biosensors. They rely on the self-assembly of a long (~103 –104 bases) single stranded (ssDNA) DNA molecule (the scaffold) into a target nanostructure with the assistance of short oligonucleotides (the staples). Scaffolds are usually purified by (i) extraction of phage genomic DNA, produced in E. coli, which has sequence limitations and raises safety concerns regarding contamination of following cultures, preventing the scalability potential of the technique and its applications, or (ii) by agarose gel extraction., which is a laborious, time consuming, limited and not scalable technique that presents low recovery, delivers low-quality products, and requires specific equipment, making it not suitable for pharmaceutical or analytical applications. The main goal of this work is to improve the recovery and quality of ssDNA scaffolds. Firstly, a phage-free method, in E. coli, called reverse infection was used to produce ssDNA scaffolds containing random sequences based on the use of a helper plasmid and phagemid particles. This method allowed the generation of high titers of phagemid particles not capable of selfreplicating, overcoming the safety concerns related with phage production. On the other hand, production of ssDNA scaffolds using asymmetric PCR (aPCR) was also explored. Besides generating the target ssDNA molecules, contaminants of aPCR comprise double stranded DNA, dNTPs, excess of primers and enzyme. To purify these mixtures two approaches were tested: (i) affinity between functionalized magnetic beads and the target ssDNA and (ii) anionexchange and multimodal chromatography as a scalable platform for the purification of ten aPCR mixtures. An analytical chromatography tool based on ion-pair reverse phase high performance liquid chromatography was also developed for the quantification of ssDNA scaffolds. Finally, the applicability of DNA-origami tetrahedrons for bio-imaging and as a drug delivery model was evaluated by optical spectroscopy and microscopy techniques.