Genetic engineering of mesenchymal stromal cells to express anti-cancer proteins

26/10/2021

Atualmente, o sucesso dos tratamentos anti-cancerígenos convencionais é limitado pela falta de seletividade destes métodos, levando a efeitos secundários severos e falta de eficácia terapêutica. Como tal, o desenvolvimento de novas estratégias que atingem seletivamente o microambiente tumoral tem sido um dos pontos centrais da investigação na área do cancro. As abordagens recentes aplicam sistemas personalizados de entrega de fármacos e, recentemente, as terapias baseadas em células têm sido desenvolvidas para a entrega específica de novas fórmulas terapêuticas anti-tumorais. Nesta perspetiva, as células estromais do mesênquima (CEM) têm um elevado potencial terapêutico, devido ao seu potencial de migração específica para zonas tumorais. Nesta tese, foram desenvolvidos protocolos não virais e sem componentes de origem animal (xeno-free) para a engenharia de CEM para a expressão e secreção da proteína anti-tumoral azurina (hazu). Numa primeira linha de estudo, um método de expressão transiente de azurina foi desenvolvido como uma prova de conceito para a aplicação de CEM a expressar azurina no tratamento do cancro, através do efeito parácrino do seu meio condicionado (MC) enriquecido com azurina. Demonstrou-se que as CEM a expressar azurina preservam o seu tropismo tumoral nativo perante as linhas cancerígenas de mama e de pulmão, de forma equiparável com as suas versões não modificadas. Além disso, a azurina foi detetada no MC de hazu-CEM, e após a exposição das células cancerígenas a este MC, verificou-se uma diminuição da proliferação, migração e invasão celular, assim como um aumento da morte celular para ambas as linhas de células cancerígenas. Numa segunda linha de estudo, optimizou-se um protocolo para o estabelecimento de uma linha de CEM com expressão estável de transgenes aplicando o sistema CRISPR/Cas9. Direcionou-se a inserção do gene hazu para o locus AAVS1 localizado no gene PPP1R12C, considerado um local seguro para inserção de material genético exógeno no genoma humano, alcançando 11.6% de eficiência de inserção através do processo de reparação por recombinação homóloga. Ao inserir o gene hazu de uma forma precisa no genoma das CEM, poder-se-á, por um lado, aplicar estas células como uma terapia celular, tirando partido do seu tropismo tumoral inato e potencial secretório; e poder-se-á também estabelecer uma linha celular que produz, de forma estável, um bioativo anti-tumoral adoptando o seu MC como uma estratégia de base celular, mas sem células (cell-free). Para além disso, prevê-se que outros transgenes terapêuticos poderão ser estudados aplicando o protocolo aqui desenvolvido, visando diferentes doenças ou contextos biológicos que não a terapia do cancro. Desta forma, prevê-se que este trabalho impulsionará estudos futuros para a edição precisa do genoma de CEM, com um elevado potencial de adequação a um cenário GMP com vista à sua aplicação clínica. The success of conventional anti-cancer treatments if often constrained by their lack of specificity, which is accompanied by severe side effects and lack of therapeutic efficacy. As such, the development of new tumor-targeted strategies has been one of the focal points of cancer research. Novel approaches focus on selective tumor targeting by applying customized drug delivery systems and, recently, cell-based therapies have been explored as living tools for the delivery of anti-tumor therapeutics. In this perspective, mesenchymal stromal cells (MSC) hold a promising future, due to their unique tumor-specific migratory potential. Here, nonviral, serum/ xeno-free, strategies for the engineering of MSC towards the expression and secretion of the potent anti-tumoral protein azurin (hazu) were developed. In a first line of research, a transient gene delivery method was developed as a proof-of-concept to attest the biomedical potential of hazu-expressing MSC’s conditioned media (CM) in anti-cancer treatment. Engineered hazu-MSC were shown to preserve tumor tropism toward breast and lung cancer cell lines, comparable to non-modified MSC. Moreover, hazu was detected in the CM of engineered cells and, upon treatment with hazu-MSC-CM, a decrease in cancer cell proliferation, migration, and invasion was observed, as well as an increase in cell death for both cancer cell lines. In a second line of research, a protocol for the establishment of a stable transgene-expressing MSC line was developed, through the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system. The AAVS1 locus located on the PPP1R12C gene was targeted, a genomic safe harbor (GSH) in the human genome, achieving 11.6% homology directed repair knock-in efficiency. By stably inserting the hazu gene into MSC genome, MSC could be employed as a cellular therapy, taking advantage of their innate tumor tropism and secretory potential; in addition, it could be disclosed a streamline for the production of a bioactive anti-tumoral CM product, by employing hazu-MSC as a continuous living factory. Importantly, using the system established herein, other therapeutic transgenes could potentially be targeted, aiming at different disease or biological contexts other than cancer therapy. Thus, it is anticipated that the work here developed will boost precise MSC genome editing, under conditions amenable to GMP compliance, envisioning a clinical application scenario.

Autores da comunidade :

• 

  M

  Marília Maria Rodrigues da Silva

  ist423225

Orientadores desta instituição:

• 

  N

  Nuno Bernardes

  ist153406

• 

  C

  Cláudia Lobato da Silva

  ist31519

101547331

Dotoramento em Bioengenharia

industrial-biotechnology - Biotecnologia Industrial

Palavras-chave

• células estromais do mesênquima
• edição genética não-viral
• CRISPR/Cas9
• azurina
• terapia anti-cancerígena
• mesenchymal stromal cells
• non-viral gene editing
• CRISPR/Cas9
• azurin
• anticancer therapy

eng - Inglês

Instituto Superior Técnico