Scalable production of extracellular vesicles derived from mesenchymal stromal cells for cancer-targeted drug delivery

Miguel de Almeida Fuzeta

Informações chave

Autores:

Miguel de Almeida Fuzeta (Miguel de Almeida Fuzeta)

Orientadores:

Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva (Cláudia Lobato da Silva); Diana Maria Diez Gaspar; Nuno Filipe Santos Bernardes (Nuno Bernardes)

Publicado em

27/10/2021

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) têm tido especial destaque na última década pelas suas aplicações promissoras tanto como agentes intrinsecamente terapêuticos em medicina regenerativa, bem como veículos para entrega de fármacos. Em particular, as células estromais mesenquimais (MSC) têm sido consideradas uma fonte promissora para a produção de EVs para aplicações biomédicas, tendo em conta as suas propriedades terapêuticas inerentes, um perfil de segurança favorável e uma boa capacidade de expansão quando cultivadas ex vivo. Apesar do potencial promissor das EVs para aplicações terapêuticas, ainda estão em falta processos de produção escaláveis e robustos. Neste trabalho, foi implementado um sistema de cultura baseado em “microcarriers” num bioreactor “Vertical-Wheel™”, em condições de cultura sem soro nem componentes de origem xenogénica (S/XF), utilizando como suplemento de cultura um lisado de plaquetas humanas, tendo em vista a produção escalável de EVs produzidas por MSC (MSC-EVs). Foram produzidas EVs utilizando MSC isoladas a partir de três fontes de tecido humano diferentes (medula óssea (BM), tecido adiposo (AT) e matriz do cordão umbilical (UCM)). Quando comparado com sistemas de cultura estáticos (i.e. T-flasks), o sistema implementado no bioreactor aumentou o rendimento de produção de EVs (5.7 vezes no global), tendo inclusivamente estimulado a secreção de uma quantidade superior de EVs por cada célula (3 vezes superior no global), após isolamento de EVs recorrendo a um kit de precipitação comercial. A actividade funcional de MSC-EVs tanto de BM como de UCM foi estudada em condições passíveis de serem transpostas para um contexto clínico. As MSC foram cultivadas em condições S/XF em sistemas planares e foi aplicado um método de isolamento de EVs escalável e selectivo, baseado em cromatografia de exclusão molecular (SEC). Tanto as MSC-EVs com origem em BM como em UCM apresentaram uma actividade pro-angiogénica semelhante, aumentando a formação de protrusões celulares em esferoides de células endoteliais num modelo 3D in vitro, levando a um aumento do comprimento total destas protrusões por esferoide em 1.9 vezes. Por fim, MSC-EVs isoladas por SEC foram modificadas à superfície com o péptido p28 para desenvolver sistemas de entrega de fármacos anti-cancerígenos. Este péptido derivado da proteína bacteriana azurina tem a capacidade de entrar preferencialmente em vários tipos de células de cancro. Neste trabalho observámos que o p28 aumentou em 2.4 vezes a internalização de EVs em células de cancro de mama, revelando a possibilidade de utilizar MSC-EVs decoradas com p28 para o desenvolvimento de novos sistemas de entrega de fármacos baseados em EVs para terapia de cancro. No global, ao longo desta tese foi demonstrada a possibilidade de usar estratégias de produção passíveis de serem transpostas para um contexto clínico, por forma a obter MSCEVs aplicáveis tanto para medicina regenerativa, demonstrando a sua capacidade proangiogénica inerente, bem como para entrega de fármacos, devido à possibilidade de modificar estas MSC-EVs com péptidos direccionados para células de cancro. Extracellular vesicles (EVs) have been the focus of great attention over the last decade for their promising application both as intrinsically therapeutic agents in regenerative medicine and as drug delivery vehicles. In particular, mesenchymal stromal cells (MSC) have been regarded as a promising source for the production of EVs for biomedical applications, considering their intrinsic beneficial therapeutic properties, favorable safety profile and good expansion capacity when cultured ex vivo. In spite of the promising potential of EVs for therapeutic applications, robust and scalable manufacturing processes for EV production are still lacking. In this work, a serum-/xeno-free (S/XF) microcarrier-based culture system was implemented in a Vertical-Wheel™ bioreactor, employing a human platelet lysate culture supplement, towards the scalable production of MSC-derived EVs (MSC-EVs). EVs were produced using MSC isolated from three different human tissue sources (bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and umbilical cord matrix (UCM)). When compared to static culture systems (i.e. T-flasks), the bioreactor system improved EV manufacturing yields (5.7-fold increase overall) and stimulated the secretion of more EVs per cell (3-fold increase overall), after EV isolation using a commercial precipitation kit. The functional activity of both BM and UCM MSC-EVs was studied in conditions closely translatable to a clinical setting. MSC were cultured under S/XF conditions using planar systems, and a scalable and selective EV isolation method based on size exclusion chromatography (SEC) was applied. Both BM and UCM MSC-EVs revealed a similar proangiogenic activity, by improving sprouting of endothelial spheroids in a 3D in vitro model, leading to 1.9-fold increase in total sprouting length per spheroid. Lastly, SEC-isolated MSC-EVs were surface-modified with the p28 peptide to develop anticancer drug delivery systems (DDS). This peptide derived from the bacterial protein azurin is able to preferentially enter a variety of cancer cells. Here we observed that p28 increased EV uptake into breast cancer cells by 2.4-fold, revealing the possibility to functionalize MSC-EVs with p28 for the development of novel EV-based DDS for cancer therapy. Overall, it was demonstrated throughout this thesis the possibility of using manufacturing strategies closely translatable to clinical settings to obtain MSC-EVs applicable both for regenerative medicine, by demonstrating their inherent pro-angiogenic capacity, as well as for drug delivery, due to the possibility to modify these MSC-EVs with a cancer-targeting peptide.