A phenylboronate chromatography based approach as an effective alternative for the downstream processing of biomolecules

Sara Alexandra da Silva Lourenço Rosa

Key information

Authors:

Sara Alexandra da Silva Lourenço Rosa (Sara Alexandra da Silva Lourenço Rosa)

Supervisors:

Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo (Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo); Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva (CLÁUDIA ALEXANDRA MARTINS LOBATO DA SILVA- Investigadora)

Published in

09/09/2019

Abstract

O potencial terapêutico dos anticorpos monoclonais (mAbs) tem vindo a crescer significativamente a nível mundial. Actualmente, existem mais de 70 produtos em uso clínico para o tratamento de diversas doenças contudo, o acesso geral da população a estes continua a ser impedido pelos altos preços praticados. Como uma elevada parcela dos custos está associada ao processo de fabrico, ao desenvolverem-se processos mais eficientes, poder-se-á conseguir que um maior número de doentes usufrua do potencial terapêutico dos mAbs. Esta tese tem como principal objectivo o desenvolvimento de um processo de purificação de mAbs baseado na cromatografia de fenilboronato que constitua uma alternativa à dispendiosa captura por proteína A habitualmente utilizada. Inicialmente foram investigados os fenómenos envolvidos na adsorção de um mAb específico para a interleucina-8 humana ao ligando sintético maminofenilboronato. A combinação do uso da calorimetria de fluxo com ensaios cromatográficos permitiu compreender o comportamento multimodal do ligando assim como que a sua tolerância ao sal pode ser aumentada manipulando as condições cromatográficas. O ligando foi depois avaliado para a captura directa do mAb proveniente de sobrenadantes de culturas celulares. O desenvolvimento de um passo intermédio e a optimização da eluição foram essenciais para alcançar bons parâmetros de desempenho, reprodutíveis em todas as escalas testadas (0.4-40 mL de resina). O processo desenvolvido proporciona recuperações de 97.7%, purezas de 82.6% e remoções de DNA genómico superiores a 96%. Nesta tese foi, também, possível demonstrar que o m-aminofenilboronato pode ser usado para a captura e eluição selectiva de diferentes tipos de proteínas – glicoproteínas, com diferentes pontos isoeléctricos e proteínas acídicas/neutras, glicosiladas ou não – pelo uso de competidores como o Tris e o citrato, respectivamente. Os resultados obtidos pretendem contribuir para a adoção da cromatografia de fenilboronato para a captura ou polimento de mAbs ou até para a separação de isoformas, por métodos analíticos. The potential of therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) has increased significantly, with more than 70 products in clinical use worldwide for the treatment of different diseases. The access of the general population to mAbs is unfortunately barred by high-selling prices. If mAbs were cheaper, a larger number of individuals would benefit from their therapeutic potential. Since a significant fraction of the costs is attributed to the manufacturing, one way to achieve this is to develop more efficient processes. This thesis aims to develop a purification process based on phenylboronate chromatography as an alternative to the costly protein A capture step currently used in the purification train of mAbs. To achieve this goal, the phenomena underlying the adsorption of an anti-human IL-8 (anti-IL8) mAb onto an maminophenylboronic acid synthetic ligand was thoroughly investigated. The combination of on-line flow microcalorimetry and chromatographic assays allowed to understand the multimodal behaviour of the ligand and that its salt tolerance can be enhanced by manipulating the chromatographic conditions. The ligand was then challenged for the direct capture of anti-IL8 mAb from cell culture supernatants. The development of a washing step and the optimization of the elution step were crucial to the achievement of good performance parameters reproducible at every scale tested (0.4 to 40 cm3 resin volume). This process yields recoveries of 97.7%, purities of 82.6% and gDNA removals higher than 96%. It was also possible to demonstrate that this ligand can be useful for the capture and effective separation of a wide range of proteins from glycoproteins, differing in overall charge, to acidic/neutral proteins (glycosylated or not), by the use of displacers as Tris and citrate, respectively. The results obtained are expected to contribute towards the adoption of such chromatographic process either for mAb capture or polishing steps or for analytical purposes, envisaging isoforms separations.