Escherichia Coli genome engineering for improved minicircle production

Cláudia Patrícia Almeida Alves

Key information

Authors:

Cláudia Patrícia Almeida Alves (Cláudia Patrícia Almeida Alves)

Supervisors:

Gabriel António Amaro Monteiro (Gabriel A. Monteiro); Duarte Miguel de França Teixeira dos Prazeres (Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres)

Published in

05/14/2021

Abstract

últimos 20 anos tem sido registado um elevado interesse em vectores não-virais para aplicações em terapia génica e vacinas de DNA. Os plasmídeos têm sido usados neste contexto, apesar da sua baixa eficiência de transfecção e expressão génica. A incerteza relacionada com a segurança destes vectores levou ao desenvolvimento de vectores não-virais mais seguros e eficientes, incluindo os minicírculos. Estas moléculas circulares de DNA não contêm sequências procarióticas, sendo por isso associadas a uma entrega de genes mais segura e a uma maior expressão quando comparadas com plasmídeos convencionais. A produção de minicírculos é efectuada em Escherichia coli a partir de um plasmídeo parental que, após recombinação intramolecular, origina miniplasmídeos contendo a informação procariótica e minicírculos com a informação terapêutica. Apesar das suas vantagens, os processos de produção actuais apresentam baixa produtividade, sendo evidente a necessidade de desenvolver estirpes de E. coli melhoradas e com capacidade de produzir minicírculos em quantidade suficiente para ensaios pre-clínicos e clínicos. Com o objectivo de melhorar a produção de minicírculos em E. coli, optimizou-se a sequência não codificante da resolvase ParA, envolvida na recombinação do plasmídeo parental, resultando numa recombinação com o dobro da eficiência relativamente à sequência optimizada anteriormente. Para melhorar o rendimento de produção, foi utilizado um método de engenharia genómica baseado na tecnologia CRISPR/Cas9. Neste contexto, foram construídas cinco estirpes por eliminação dos genes pykA, pykF e pgi envolvidos no metabolismo de carbono, com o intuito de aumentar a produção de plasmídeo em E. coli. Apesar de serem obtidos resultados promissores com a delecção do gene pgi, os resultados de produção são ainda inconclusivos. Foi também contruída uma estirpe contendo uma cassete com a nova sequência para optimização da recombinação (PBAD/araC-par3A). Finalmente, foi desenvolvido um método de qPCR para detecção específica de plasmídeo parental, miniplasmídeo e minicírculo, aplicável na determinação da eficiência de recombinação em amostras puras de DNA. In the last 20 years, a high interest has been registered in non-viral vectors for gene therapy and DNA vaccination applications. In this context, plasmid DNA has been used advantageously although presenting low transfection efficiency and transgene expression. Also, some minor concerns regarding their safety have been raised. Therefore, efforts were made to develop safer and more efficient nonviral delivery vectors, which led to the creation of minicircle vectors. Minicircles are plasmid-derived DNA molecules devoid of bacterial sequences, which can safely deliver a gene of interest to cells, allowing for a higher expression when compared to conventional plasmids. Minicircles are produced in Escherichia coli by replicating a parental plasmid and inducing its intramolecular recombination into miniplasmid and minicircle molecules. Despite the advantages of minicircles, current manufacturing processes present low yields. This highlights the need for E. coli strains with improved capability to produce the amounts of minicircle required for gene therapy and DNA vaccination pre-clinical and clinical trials. The main goal of this work is to improve minicircle production in E. coli. In pursuit of this objective, the 5’-untranslated region of the ParA resolvase gene was optimized, generating a sequence (PBAD/araC-par3A) that improves recombination efficiency by ≈2-fold over a previously optimized cassette. To improve production yield, CRISPR/Cas9-mediated genome engineering was further used to modify the expression of genes in the central carbon metabolism as a strategy to achieve a high parental plasmid producing E. coli strain. This resulted in the construction of five new strains with knockouts in the pykA, pykF and pgi genes. While promising results were obtained for the pgi knockout, current production yield studies are still inconclusive. A strain harboring the above referred cassette with the new ParA 5’- UTR in the genome was also constructed. Finally, a real-time PCR based method for molecule-specific detection of recombination products was developed and successfully used to determine recombination efficiencies in pure DNA samples.