The genetics of primary ciliary dyskinesia: from the flagellum to the cilium

14/11/2019

A discinesia ciliar primária (PCD) é uma doença rara autossómica recessiva cujas alterações génicas cursam com anomalias do axonema, o motor ciliar. O axonema é um cilindro composto por 9 dupletos de microtúbulos periféricos, que incluem dois braços de dineína (DA), que se encontram ligados entre si pelo complexo regulador das dineínas (DRC) e conectados a um par central de microtúbulos por projeções radiais. Os pacientes com PCD apresentam infeções respiratórias crónicas, podendo associar-se (em cerca de 50% dos casos) a situs-inversus-totalis (clinicamente designado por síndrome de Kartagener (KS)) e à infertilidade. A presente tese de doutoramento teve como principal questão perceber que variantes genéticas conduzem à KS e ausência dos DA no axonema. Para tal, pacientes com essas características foram selecionados e realizada a completa do exoma (WES). A segunda questão aqui levantada, foi de que modo as variantes encontradas afetam a expressão génica e proteica, no sentido de melhor compreender a relação genótipo-fenótipo. Esta tese iniciou-se com a análise genética por sequenciação de Sanger de pacientes com total imotilidade dos espermatozoides. Porém, num dos pacientes, que apresentava KS e ausência dos DA no axonema dos espermatozoides, o estudo genético foi inconclusivo, tendo-se procedido à sua avaliação por WES, de que resultou na identificação de uma nova variante no gene CCDC103. Este gene foi descrito como um fator importante para o “assemble” dos DA, mas encontra-se pouco caracterizado nos humanos. Assim, neste trabalho, foi evidenciado que a estratégia de sequenciação genea-gene não é efetiva para a PCD e despoletou interesse para o estudo mais detalhado dos perfis de expressão do gene CCDC103. Assim, 2 pacientes com KS e portadores de variantes patogénicas neste gene foram estudados. Os resultados sugerem que essas variantes causam ausência dos DA, e afetam a expressão do gene e da proteína. Adicionalmente, verificamos que o gene CCDC103 é expresso em diferentes tipos de células, sendo que os espermatozoides apresentam uma maior expressão do gene, e a proteína uma localização celular distinta. A presença de isoformas proteicas observada, sugeriu modificações pós-translacionais, sugerindo que CCDC103 pode desempenhar uma função regulatória. Seguidamente, o exoma de 3 crianças, com anomalias nos DA e com KS, foi analisado por WES e realizada a correlação genótipo-fenótipo nas crianças e respetivas famílias. Numa das crianças encontraram-se variantes patogénicas em dois genes, o DNAH5 e o DNAH7. Observou-se no paciente a redução da expressão do mRNA e uma alteração localização das proteínas em ambos os genes. Noutra criança, o WES não foi suficiente para deteção de variantes patogénicas, tendo-se procedido à análise do número de cópias. Encontraram-se 3 novas variações potencialmente causadoras da doença em genes não relacionados previamente com a PCD. Deste trabalho, dois aspetos principais devem ser destacados. Primeiramente, salientamos a possibilidade de um mecanismo de interação entre dois genes (DNAH5 e DNAH7) na produção do fenótipo. Seguidamente, os dados permitiram-nos salientar as limitações do WES. Na última parte desta tese, estudos preliminares, salientam a importância, da aplicação de ferramentas bioinformáticas, nomeadamente as regiões em homozigotia a partir de dados de WES. Estas permitem adjuvar na filtragem das variantes e assim a melhorar o diagnostico. De modo geral, os resultados aqui obtidos contribuem para melhorar os conhecimentos sobre os fatores genéticos envolvidos na patofisiologia da PCD/KS e imotilidade do flagelo. Estes são de extrema importância para auxiliar o diagnóstico genético e no desenvolvimento de futuras terapias. Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a rare ciliopathy caused by dysfunction of motile cilia. The axoneme, the main motor of cilia, is composed of 9 peripheral microtubule doublets, each possessing two dynein arms (DA). The doublets are linked by the dynein regulatory complex (DRC) and connected to a single pair of central microtubules, by radial spokes (RS). Defects in motile cilia impairing its proper function, cause ineffective mucociliary clearance, organ laterality defects (known as situs inversus) and infertility. Kartagener's syndrome (KS) occurs in half of PCD patients and is characterized by a triad of situs inversus, chronic sinusitis, and bronchiectasis. The main aim of the present doctoral thesis was to study the genetic background of patients presenting KS with an absence of DA in its axoneme. To achieve this goal, KS patients with DA defects were selected and whole exome sequencing (WES) was performed. The second question raised here was how the variants found affect gene and protein expression, to better understand the genotype-phenotype correlation. This thesis initiated with the genetic analysis by Sanger's sequencing of patients with total sperm immotility. In one of the patients, who had KS and absence of DA in the sperm axoneme, the genetic study was inconclusive and was evaluated by WES, which resulted in the discovery of a new variant in the CCDC103 gene, that codes for a small protein shown to be essential for DA assembly, but which is weakly characterized in humans. Thus, it was evidenced that the gene-to-gene sequencing strategy is not effective for PCD and prompted interest to study CCDC103 gene expression profiles. Consequently, 2 patients with KS and carriers of pathogenic variants in this gene were studied. The results suggest that those variants cause the absence of DA and affect gene and protein expression. In addition, we found that the CCDC103 gene is expressed in different cell types, with the spermatozoa having higher expression of the gene, and a different cellular location of the protein. The presence of protein isoforms observed, suggested post-translational modifications, suggesting that CCDC103 may play a regulatory role. Subsequently, the exome of 3 children, with abnormalities in DA and KS, was analysed by WES and performed genotype-phenotype in children and their families. In one of the children, pathogenic variants were observed in two genes, DNAH5 and DNAH7. Reduction of mRNA expression and a mislocalization of the proteins in both genes were observed. In another child, the typical analysis by WES do not found pathogenic variants. Further analyses by different approaches (including copy number variation, (CNV)) finally revealed possible novel candidates for PCD. From this work, two aspects should be highlighted. Firstly, the possibility of a mechanism of interaction between two genes (DNAH5 and DNAH7) in the production of the phenotype is highlighted. From this analysis two main conclusions are highlighted. Firstly, we hypothesized a model in which multiple variants in distinct genes, may have combined effects in PCD phenotype. Second, the data from the other children, emphasis the WES limitations as with the implementation of the typical workflow no disease-causing variants were found. Further analyses by different approaches (including copy number variation, (CNV)) finally revealed possible novel candidates for PCD. Finally, preliminary data highlighted the importance of application of ‘runs’ of homozygosity from WES data as an effective tool to assist variant filtering and aiming to improve the diagnostic yield. Overall, the results obtained during this research thesis contribute to increasing the understanding of the genetic factors involved in pathophysiology of PCD/KS and sperm motility, which is of paramount importance to assist the current diagnosis, and for the development of novel therapies in the future.

Autores da comunidade :

• 

  R

  Rute Ribeiro Pereira

  ist424026

Orientadores desta instituição:

• 

  J

  Joaquim Manuel Sampaio Cabral

  ist11432

101630409

Doutoramento em Bioengenharia

industrial-biotechnology - Biotecnologia Industrial

Palavras-chave

• Axonema
• cílios móveis
• Discinesia ciliar primária
• sequenciação de exoma
• síndrome de Kartagener
• Axoneme
• Motile cilia
• Primary ciliary dyskinesia Dynein arms
• Whole exome sequencing
• Kartagener syndrome

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