Cerebellar organoids derived from hiPSCs to model angelman syndrome

28/10/2022

A tecnologia das células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs) abriu novas perspetivas para a geração de qualquer tipo de células humanas e consequentemente modelos in vitro mais avançados. Derivativos de hiPSCs têm o potencial para modelar doenças, contribuir para a triagem de fármacos e potencialmente gerar novas abordagens para medicina regenerativa. A Síndrome de Angelman (SA) é uma doença rara do neurodesenvolvimento caracterizada pela ausência da expressão monoalélica materna do gene UBE3A nos neurónios e causada por megadeleção (70-80%), mutação no UBE3A (10-20%), dissomia uniparental (3-5%) ou defeitos de imprinting (3-5%). Os doentes apresentam ataxia, convulsões, atraso global no desenvolvimento, problemas na comunicação e um comportamento “alegre”. Até agora a maioria do conhecimento recolhido sobre a SA foi possível graças a modelos de ratinho. Porém, o fenótipo é menos severo que o apresentado pelos doentes e o modelo mais utilizado não mimetiza os casos mais comuns de SA. Assim, é urgente o desenvolvimento de novos modelos humanos in vitro para se estudarem as características patológicas da SA. O objetivo desta tese é contribuir para um melhor conhecimento da SA, através de: i) criação e caracterização de um modelo organoide para as duas causas genéticas mais comuns; ii) criação de uma nova linha de iPSCs derivada de doente; e, iii) caracterização da comunidade SA em Portugal. Uma vez que a ataxia é uma das características consistentes, este estudo começou com a principal hipótese de que o cerebelo podia estar afetado na doença. Assim, os organoides de cerebelo criados a partir de linhas iPSC de doentes demostraram a recapitulação do desenvolvimento do cerebelo e do imprinting genómico, sendo um modelo fiel para o estudo da SA. Os organoides de cerebelo gerados a partir de linhas iPSCs de doentes com megadelação exibiram consistentemente um tamanho reduzido bem como taxa de expansão do neuroepitélio cerebelar, e rácio alterado de progenitores para os tipos de neurónios excitatórios e inibitórios do cerebelo. Análises funcionais através de imagiologia dos transientes de cálcio e estudos eletrofisiológicos mostraram defeitos funcionais nos neurónios do cerebelo com um elevado grau de imaturidade e um fenótipo excitatório. Estes resultados evidenciam pela primeira vez num modelo humano que a disfunção cerebelar contribui para a sintomatologia da doença. Dada a importância das causas genéticas nesta doença, também foram gerados organoides de cerebelo derivados de linhas iPSCs de doentes com a mutação no UBE3A. Estes organoides mostram similaridades com os de megadeleção, nomeadamente tamanho reduzido e desequilibro na proporção progenitores excitatórios/inibitórios, porém com um fenótipo mais moderado em fazes tardias do desenvolvimento. Estudos futuros são necessários para um melhor entendimento destas diferenças. Atualmente, existem poucas linhas iPSCs derivadas de doentes e estudos que utilizem organoides humanos para decifrar a SA. Desta forma, foi também criada e caracterizada uma nova linha de iPSCs derivada de uma criança com megadeleção. Com esta linha celular, que está disponível para a comunidade científica, contribuiu-se para o aumento do portfolio dos modelos pré-clínicos de células estaminais existentes para a SA. Por fim, uma das nossas preocupações é a comunicação com doentes de SA e osseus familiares. Com a ajuda da ANGEL – Associação Síndrome de Angelman de Portugal, desenvolveram-se actividades com os doentes e os seus familiares, por forma a aumentar a consciencialização para esta doença e encetar melhores estratégias de comunicação de ciência relacionadas com SA. O corolário destas actividades é a primeira caracterização da comunidade portuguesa de SA. Em conclusão, o trabalho apresentado é o primeiro a gerar modelos de organoide de cerebelo para as duas causas genéticas mais comuns de SA, megadeleção e mutação no UBE3A, o que permitiu contribuir para a compreensão do papel do cerebelo na doença. Também esperamos ter chamado a atenção para esta doença rara, contribuindo com modelos de células estaminais e sendo solidários para com a comunidade de SA. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) technology has opened new perspectives for the generation of any type of human cells and consequently more advanced in vitro models. hiPSCs derivatives have the potential for disease modeling, drug screening and regenerative medicine applications. Angelman Syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disorder characterized by a lack of maternal monoallelic expression of UBE3A in neurons and caused by megadeletion (70-80%), UBE3A mutation (10-20%), uniparental disomy (3-5%) or imprinting defects (3-5%). The patients present ataxia, seizures, developmental delay, speech impairment and happy demeanor. Until now, the main knowledge about AS has been gathered from mouse models. However, phenotype is less severe than in human patients and the most used model does not mimic the most common cases of AS. Thus, it is urgent to develop new in vitro human models for studying the pathological features of AS. The main goal of this thesis is to contribute to a better understanding of AS, through: i) the generation and characterization of an organoid model for two most common genetic causes; ii) the creation of a new patient-derived iPSC line; and iii) the characterization of the AS community in Portugal. Since ataxia is one of the consistent features of AS, this study started with the main hypothesis that cerebellum could be affected in this disease. Thus, cerebellar organoids generated from patient-derived iPSC lines show to recapitulate the cerebellar development and to model the genomic imprinting, being a feasible model to study AS. Cerebellar organoids generated from megadeletion patients iPSCs consistently exhibit reduced size and expanded rates of cerebellar neuroepithelium and altered ratio of progenitors for excitatory and inhibitory cerebellar neurons. Functional analysis by calcium imaging and electrophysiological studies demonstrated functional defects of cerebellar neurons with high degree of immaturity and an excitatory phenotype. These data provide, for the first time in a human model, a clear demonstration that cerebellar dysfunction contributes to the disease symptomatology. Due to the importance of understanding the different genetic causes, we also generated cerebellar organoids derived from UBE3A mutation iPSCs. These organoids showed similarities with megadeletion ones, namely reduced size, and imbalance of excitatory/inhibitory progenitors, however with milder phenotype at later stages. Further studies are needed to better understand these differences. Currently, there are few iPSCs lines and human organoids studies to decipher AS, thus we generated and characterized a new iPSC line derived from a female child with megadeletion. With this new cell line, which is available for scientific community, we are contributing for increasing the portfolio of available pre-clinical stem cells models of AS. Finally, one of our major concerns is communicating with AS patients and their families through ANGEL – Associação Síndrome de Angelman de Portugal. With the help of this association, we learn with patients and families, raise awareness for this disorder and communicate science. We also promoted, for the first time, an initial characterization of the AS community in Portugal. Overall, the presented work is the first to generate AS cerebellar organoid models for both megadeletion and UBE3A mutation genetic causes, and it allowed to shed light on the contribution of the cerebellum to the disease. We also hope to have drawn attention to this rare disorder contributing with stem cell models and being supportive to the AS community in Portugal.

Autores da comunidade :

• 

  C

  Carina Sofia Barradas Maranga

  ist191498

Orientadores desta instituição:

• 

  E

  Evguenia Pavlovna Bekman Gaspar

  ist428030

• 

  T

  Tiago Paulo Gonçalves Fernandes

  ist147740

101715366

Doutoramento em Bioengenharia

industrial-biotechnology - Biotecnologia Industrial

Palavras-chave

• Síndrome de Angelman
• iPSCs-derivadas de doentes
• Cerebelo
• organóides cerebelares
• consciencializar para Angelman
• Angelman Syndrome
• patient-derived iPSCs
• Cerebellum
• Cerebellar organoids
• Angelman awareness

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