Development of a novel purification platform for Fab antibody fragments based on affinity peptides and multimodal ligands

André Nunes dos Santos Nascimento

Key information

Authors:

André Nunes dos Santos Nascimento (André Nunes dos Santos Nascimento)

Supervisors:

Steven M. Cramer; Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo (Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo); Pankaj Karande

Published in

04/06/2020

Abstract

Derivados de anticorpo são uma classe de proteínas idealizadas como alternativas a anticorpos monoclonais. A produção de fragmentos de anticorpo, uma das proteínas desta classe, não é eficiente, especialmente na fase a jusante do processamento. De modo a dissipar esta limitação, duas abordagens foram sugeridas como novas alternativas à purificação de Fragmentos de anticorpo. Cromatografia de afinidade, usando péptidos, e cromatografia multimodal foram as duas soluções escolhidas e avaliadas. Nesta tese, uma abordagem evolutiva, baseada na técnica de phage display, foi usada para rastear e descobrir péptidos de afinidade capazes de ligar a fragmentos de anticorpo. Três diferentes esquemas de selecção foram desenhados, onde a complexidade e foco na região constante do fragmento era aumentada. O resultado foram cinco péptidos com a capacidade de ligar a fragmentos de anticorpo. Apesar de nenhum péptido ser considerado um ligando universal, três dos cinco podem ser considerados ligandos específicos para três, ou mais, proteínas semelhantes. O uso de um dos péptidos como solução de cromatografia de afinidade foi desenvolvida, tendo a sua eficácia sido demonstrada através da purificação de fragmentos de anticorpo presente num sobrenadante complexo. O potencial de cromatografia multimodal é tão grande quanto sua complexidade. De modo a fazer um varrimento rápido de diferentes condições de cromatografia, para purificar fragmentos de anticorpo usando ligandos multimodais, uma plataforma microfluídica de alto rendimento foi usada. Um estudo exaustivo, de onze resinas multimodais, visando fragmentos de anticorpo, outras proteínas e duas misturas complexas, a diferentes pHs e concentrações de sal, foi feito. Com esta abordagem, uma selecção sustentada nos melhores ligandos e condições cromatográficas foi feita, e o desenho de uma processo de purificação totalmente baseado em ligandos multimodais foi concebido. Este trabalho lança bases para a descoberta de novas soluções de purificação para uma classe emergente de derivados de anticorpo. As duas abordagens adoptadas podem ser consideradas contribuições valiosas para um processo de purificação de fragmentos de anticorpo, ou outras biomoléculas, mais eficiente. Antibody derivatives are a class of engineered proteins idealized as alternatives to monoclonal antibodies. The production of Fab fragments, the oldest of this class, in comparison to mAbs is not as efficient, especially the downstream processing. To tackle this limitation, two different approaches were suggested as new solutions to purify Fab fragments. Peptide affinity chromatography and multimodal chromatography were the chosen and evaluated solutions. In this thesis an evolutive approach, based on phage display, was taken to screen and discover peptide affinity ligands capable of binding to Fab fragments. Three different biopanning schemes were designed, with increase complexity and increased focus on the constant regions of Fabs. The outcome were five different peptides with the ability to bind Fab fragments. While a truly universal ligand was not identified, three of those obtained peptides can be considered ligands specific to three or more closely related biologics. The application of one of those peptides as a chromatographic affinity solution was developed, and its efficacy was demonstrated for Fab purification from a complex cell culture fluid mixture. The potential of multimodal chromatography is as big as its complexity. To rapidly screen chromatographic conditions to purify Fab fragments using multimodal ligands, a highthroughput platform, based on chromatographic microfluidics was applied. An exhaustive study of eleven multimodal resins, targeting Fabs, other proteins and two complex mixtures, at different pH and salt conditions was executed. With this high-throughput approach a sustained selection of the best ligands and chromatographic conditions was taken, and the design of a full multimodal Fab downstream process was made. This work lays the foundation for the discovery new purification solutions for a class of emergent antibody derives. The two different approaches adopted can be considered valuable contributions for a more efficient purification process of Fab fragments and other types of biomolecules.