Technology-Driven platform for the manufacturing of umbilical cord blood natural killer cells and derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy

May 21, 2026

As células, natural killer (NK) são linfócitos do sistema imunitário inato que desempenham um papel crucial na identificação e destruição de células infetadas ou malignas, recorrendo a grânulos citotóxicos para induzir a morte das células-alvo. Para potenciar a sua atividade antitumoral, as células NK podem ser geneticamente modificadas com a tecnologia do recetor antigénico quimérico (CAR), originando células CAR-NK, uma estratégia que tem demonstrado grande potencial no tratamento de cancro. Paralelamente, as vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células NK surgem como uma alternativa terapêutica promissora e potencialmente mais segura, uma vez que estas partilham as propriedades de reconhecimento tumoral das células parentais. Apesar do seu potencial, a aplicação generalizada tanto das células NK como das respetivas EVs é limitada por desafios na produção em larga escala, nomeadamente a expansão celular, o isolamento de EVs e a preservação da funcionalidade durante os processos de produção e armazenamento. O sangue do cordão umbilical (CB) representa uma fonte particularmente valiosa de células NK, devido à sua origem alogénica, baixa imunogenicidade e facilidade de recolha, tornando-o especialmente adequado para aplicações terapêuticas alogénicas “prontas a usar”. Este projeto tem como objetivo estabelecer uma plataforma de produção para células NK(CB) humanas e respetivas EVs, incorporando estratégias eficientes de produção e purificação que suportem a sua futura aplicação clínica. Inicialmente, células CD56⁺ foram isoladas a partir de amostras de CB, utilizando separação magnética (MACS), e expandidas em diferentes meios de cultura suplementados com interleucina-2, incluindo CTS™ NK-Xpander™ (NKX) com 5% de soro humano (hS), GMP SCGM, NK MACS® com 1% ou 2% de suplemento (NKM1 e NKM2, respetivamente) e 5% hS, PRIME-XV NK Cell CDM, StemSpan™ SFEM II e X-VIVO™ 15. As células NK(CB) foram caracterizadas fenotipicamente por citometria de fluxo e a sua funcionalidade foi avaliada através de ensaios de degranulação e citotoxicidade com a linha celular K562. Entre as condições testadas, NKX, NKM1 e NKM2 demonstraram melhor expansão e ativação funcional, com aumento da degranulação e do potencial citotóxico após a expansão. Para explorar estratégias alternativas de isolamento, a separação por flutuação (BACS) foi testada em paralelo com o MACS, com o objetivo de avaliar a eficiência de enriquecimento de células CD56⁺ e o impacto subsequente na expansão e função das NK(CB). Os resultados mostraram que o BACS permite o enriquecimento eficiente de células CD56+ derivadas do sangue do cordão umbilical, preservando a sua competência funcional, o que suporta a sua utilização como uma estratégia de enriquecimento alternativa. Na segunda fase do estudo, foi estabelecida uma plataforma de produção de EVs derivadas de NK(CB). Foi implementada uma etapa de condicionamento com o meio NKX, sem hS ou suplementado com lisado plaquetário humano isento de EVs (hPL.EVd). Foram comparados dois regimes de renovação de meio - a cada 24 ou 48 horas - para avaliar o impacto na viabilidade celular e no rendimento de produção de EVs. As EVs foram isoladas por cromatografia de troca aniónica, caracterizadas segundo as diretrizes MISEV2023 e avaliadas quanto à sua atividade citotóxica. A condição NKX-hPL.EVd preservou melhor a viabilidade das células NK(CB), sem diferenças ii significativas entre os regimes de renovação. As EVs obtidas apresentaram elevada pureza, tamanho inferior a 200 nm e morfologia adequada. Importa destacar que as EVs continham proteínas citotóxicas chave - perforina e granzima B - e demonstraram atividade antitumoral contra células K562. Após a produção de EVs, as células NK(CB) mantiveram a sua viabilidade, fenótipo e citotoxicidade, realçando o potencial de uma estratégia dupla que combina terapias celulares (NK(CB)) com terapias sem células (EVs). Por fim, foram obtidos resultados preliminares sobre a modificação genética de células NK utilizando transportadores lipídicos nanoestruturados (NLCs). Estes foram funcionalizados à superfície com quitosano, promovendo uma maior internalização celular. Os resultados suportam o potencial dos NLCs como uma plataforma não viral, biocompatível e escalável para a geração de células CAR-NK. Em conjunto, estes resultados oferecem informações cruciais sobre as condições ótimas de produção de células NK(CB) e respetivas EVs, estabelecendo as bases para processos de produção robustos e escaláveis. Esta abordagem integrada, que combina estratégias com e sem células, mostra grande potencial para o desenvolvimento de imunoterapias mais seguras, eficazes e amplamente acessíveis, facilitando a sua futura aplicação clínica. Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes that play a crucial role in identifying and eliminating infected or malignant cells, relying on cytolytic granules to induce target cell death. To enhance their anti-tumor activity, NK cells can be genetically engineered with chimeric antigen receptor (CAR) technology, generating CAR-NK cells, a strategy that has shown considerable promise in cancer treatment. In parallel, extracellular vesicles (EVs) derived from NK cells have emerged as a promising, cell-free and potentially safer therapeutic alternative, as they retain the tumor-targeting properties of their parental cells. Despite their potential, the widespread use of both NK cells and their EVs is limited by challenges in large-scale production, including cell expansion, EV isolation, and preservation of functionality throughout manufacturing and storage processes. Umbilical cord blood (CB) is a particularly valuable source of NK cells, as it combines an allogeneic origin, low immunogenicity, and ease of collection, making it especially suitable for off-the-shelf immunotherapeutic applications. This project aims to establish a manufacturing platform for both human NK(CB) cells and derived EVs, comprising efficient production and purification strategies to support their clinical translation. Initially, CD56+ cells were isolated from CB samples using magnetic-activated cell sorting (MACS) and expanded in different interleukin-2 supplemented culture media, including CTS™ NK-Xpander™ (NKX) with 5% human serum (hS), GMP SCGM, NK MACS® with 1% or 2% supplement (referred to as NKM1 and NKM2, respectively) and 5% hS, PRIME-XV NK Cell CDM, StemSpan™ SFEM II, and X-VIVO™ 15. NK(CB) cells were phenotypically characterized by flow cytometry, and their functionality was assessed through degranulation and cytotoxicity assays using the K562 cell line. Among the tested conditions, NKX, NKM1, and NKM2 supported superior expansion and functional activation, as demonstrated by increased degranulation and cytotoxic potential post-expansion. To explore alternative isolation strategies, buoyancy-activated cell sorting (BACS) was tested alongside MACS to assess their efficiency in CD56⁺ enrichment and subsequent impact on NK(CB) expansion and function. Results showed that BACS enables efficient enrichment of CB-derived CD56+ cells while preserving functional competence, supporting its use as a bead-free alternative affinity-based enrichment strategy. In the second phase of the study, a manufacturing platform for NK(CB)-EVs was established. A conditioning step was implemented using NKX medium, either without hS or supplemented with exosome-depleted human platelet lysate (hPL.EVd). Two medium renewal schedules - every 24 or 48 hours - were compared to assess their impact on cell viability and EV yield. EVs were isolated using anion exchange chromatography, characterized according to MISEV2023 guidelines, and evaluated for their cytotoxic activity. The NKX-hPL.EVd condition preserved NK(CB) cell viability most effectively, with no major differences between renewal schedules. EVs obtained were highly pure, predominantly under 200 nm in size, and exhibited the expected morphology. Importantly, EVs contained key cytotoxic proteins - perforin and granzyme B - and demonstrated anti-tumour activity against K562 cells. Following EV production, NK(CB) cells retained their viability, phenotype, and cytotoxicity, highlighting the potential of a dual strategy iv where both cell-based (NK(CB)) and cell-free (EVs) immunotherapies can be used complementarily. Finally, preliminary results were obtained on the genetic modification of NK cells using nanostructured lipid carriers (NLCs). These carriers were surface-modified with chitosan, enhancing cellular uptake. The results support the potential of NLCs as a non-viral, biocompatible and scalable platform for CAR-NK cell generation. Together, these results provide critical insights into the optimal production conditions for well-characterized NK(CB) cells and their EVs, laying the groundwork for robust and scalable manufacturing processes. This integrated approach, combining both cell-based and cell-free strategies, holds great promise for the development of safer, more effective, and widely accessible immunotherapies, paving the way for their future clinical application.

Authors in the community:

• 

  I

  Isabel Maria Pereira Doutor

  ist180766

Supervisors of this institution:

• 

  A

  Ana Margarida Pires Fernandes Platzgummer

  ist46782

• 

  P

  Pedro Ricardo Martins Lopes da Fonte

  ist428933

• 

  A

  Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo

  ist30470

101691459

Doutoramento em Bioengenharia

biological-sciences - Biological sciences

Keywords

• Umbilical Cord Blood
• Natural Killer Cells
• Extracellular Vesicles
• Nanostructured Lipid Carriers
• Immunotherapy
• Sangue do Cordão Umbilical
• Células Natural Killer
• Vesículas Extracelulares
• Transportadores Lipídicos Nanoestruturados
• Imunoterapia

eng - English

Instituto Superior Técnico

Financing entity

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Title of the project, award or grant: Technology-driven platform for the manufacturing of extracellular vesicles derived from umbilical cord blood CARengineered NK cells for immunotherapy

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Funding Stream: Bolsa de Doutoramento

Identifier for the funding entity: https://doi.org/10.13039/501100001871

Type of identifier of the funding entity: Crossref Funder

Number for the project, award or grant: UI/BD/151248/2021