Extracellular vesicles: agents of gut communication in prediabetes scenario

Inês Raquel Antunes Ferreira

Key information

Authors:

Inês Raquel Antunes Ferreira (Inês Raquel Antunes Ferreira)

Supervisors:

Maria Paula Borges de Lemos Macedo; Bruno Costa da Silva; Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva (Cláudia Lobato da Silva)

Published in

01/27/2021

Abstract

As dietas hipercalóricas, características da sociedade ocidental, estão diretamente associadas ao desenvolvimento de doenças metabólicas como é o caso da diabetes tipo 2 (DT2). Esta é considerada uma epidemia mundial, atingindo números alarmantes e despesas colossais. No sentido de prevenir a DT2 é crucial a deteção e intervenção precoce, nomeadamente na prediabetes, identificada como um estado inicial da doença, no qual ainda é possível reverter o quadro clínico através de alterações do estilo de vida. Apesar do papel fundamental do fígado no metabolismo de glucose e lípidos, um dos órgãos que se tem mostrado particularmente relevante no controlo da doença é o intestino. A cirurgia metabólica, inicialmente desenvolvida para o tratamento da obesidade mórbida, mostrou ter elevadas taxas de êxito na remissão da DT2. De salientar, que esta remissão ocorre antes da acentuada perda de peso, indicando que o intestino por si desempenha uma função primordial no controlo da DT2; contudo o mecanismo molecular subjacente a este controlo ainda não está clarificado. Desta forma o intestino ganha um papel de relevo como órgão metabolicamente ativo e potencial alvo no diagnóstico precoce e intervenção terapêutica na DT2. A homeostasia metabólica é atingida através de uma intrincada comunicação entre os diversos órgãos. Variados mediadores circulatórios, como é o caso de hormonas e citocinas participam na resposta sistémica dos diferentes órgãos metabólicos às alterações externas, nomeadamente à dieta. Nos últimos anos, foi descrito uma nova forma de comunicação no organismo denominadas de vesículas extracelulares (VE). As VEs são produzidas a partir de corpos multivesiculares formados pela via endossomal e posteriormente libertados para o meio extracelular. As VEs transportam, dentro da sua dupla membrana, material genético e proteico, assim como lípidos, de uma célula para outra vizinha, ou distante. Sabendo que os enterócitos libertam VE, neste trabalho avaliamos a hipótese de que o “millieu” intestinal, no contexto da dieta hipercalórica no modelo de prediabetes, é modificado originando alterações do conteúdo proteico das VEs derivadas do intestino (VE-intestinais) que, por sua vez, têm um efeito diabetogénico ao comunicar com o fígado, nomeadamente com as células de kupffer, responsáveis por ativar o processo inflamatório característico da T2D. Neste contexto, murganhos C57/Bl6J foram expostos a dieta normal e dieta hipercalórica durante 12 semanas, em dois grupos. As VE foram isoladas diretamente do intestino limpo, garantindo que não há contaminação de microbiota, a partir de um processo de separação por gradiente de tamanho, e adicionalmente, de densidade. Estas VE-intestinais foram analisadas pelo seu tamanho e quantidade a partir de um equipamento de rastreio de nanopartículas. Uma caraterização detalhada ao conteúdo proteico das VE-intestinais, foi efetuado por espectrometria de massa e consequente análise proteómica com ferramentas bioinformáticas. É de evidenciar que o perfil proteico das VE-intestinais de animais submetidos a uma dieta hipercalórica é amplamente alterado, concluindo que há uma clara influência da dieta no conteúdo proteico das VE-intestinais. As VE-intestinais de animais submetidos a uma dieta hipercalórica, para além do número de proteínas ser maior, também o seu perfil proteico está significativamente alterado, quando comparadas com VE-intestinais de animais saudáveis. Observámos que proteínas específicas envolvidas em vias metabólicas de hidratos de carbono, aminoácidos e lípidos estão significativamente afetadas. Nomeadamente uma diminuição de proteínas associadas à via de degradação de glucose. No entanto, as vias utilizadas por ácidos gordos encontram-se aumentadas, tanto no que toca ao catabolismo de ácidos gordos para produção de energia como de armazenamento na forma de triglicéridos. Analogamente às vias associadas ao metabolismo proteico, observamos que vias associadas a amino ácidos essenciais aparecem bastante alteradas. As vias de síntese de aminoácidos de cadeia curta, que são produzidos a partir da atividade microbiana também se encontram aumentadas. É interessante observar que, embora as VE sejam exclusivamente de origem celular intestinal, refletem efeitos da relação simbiótica que a flora intestinal tem com o intestino, evidenciada aqui em consequência do regime nutricional. Nas VE-intestinais também se observa um aumento, tanto em número como em expressão, de proteínas com função protetora contra o stress oxidativo. Stress oxidativo este muito característico de ambientes hipercalóricos onde as vias lipídicas e mitocondriais estão sobre ativadas. O que está em conformidade com o cenário fisiopatológico em estudo. Neste seguimento, vemos também, e de uma forma muito clara, que as proteínas do proteossoma, se encontram expressivamente diminuídas nas VE-intestinais de animais submetidos a dieta hipercalórica. Este resultado sugere a função celular estar comprometida, consequente da diminuição da principal via de degradação proteica. Estabelecido que as VE-intestinais se encontram alteradas pela dieta fizemos, seguidamente, o estudo do seu efeito no organismo. Para avaliação do tropismo das VE-intestinais e do seu potencial efeito fisiopatológico na disseminação da prediabetes, injetámos VE-intestinais, marcadas com fluorescência, em animais wild-type. Após injeção retro-orbital de VE-intestinais previamente marcadas em animais wild-type, observámos que estas vão preferencialmente para o fígado, em específico para as células de Kupffer, que são os macrófagos residentes deste tecido, com grande capacidade fagocítica, o que facilita a captação preferencial. O papel das células de Kupffer no metabolismo hepático tem sido recentemente evidenciado como principal ativador de inflamação. Com o objetivo de analisar o papel das VE-intestinais no fenótipo prediabético, injetámos três vezes por semana, durante seis semanas, VE-intestinais de animais submetidos a dieta hipercalórica e VEintestinais de animais submetidos a dieta normal, e analisámos alguns parâmetros metabólicos. Deste modo, e sabendo que as VE-intestinais vão maioritariamente para o fígado, observámos que, após as seis semanas, os animais não manifestam alterações estatisticamente significativas na tolerância à glucose e na resistência à insulina. Por outro lado, os fígados destes animais apresentam níveis de triglicéridos alterados, com um perfil gradual, ou seja, aqueles que apresentam valores mais elevados de triglicéridos são os animais injetados com VE-intestinais de animais submetidos a dieta hipercalórica. Estes resultados evidenciam uma relação muito interessante com a análise proteómica feita previamente. Sobressai que VE-intestinais de animais submetidos a dieta hipercalórica contêm um aumento de proteínas envolvidas no metabolismo lipídico. Em concordância, também identificámos uma família de enzimas, as ACOT, que está extremamente aumentada, e participam no direcionamento de ácidos gordos para a síntese de triglicéridos. Em suma, relativamente à nossa hipótese , observamos que as células intestinais são produtoras de VEs, e que as VE do intestino sofrem alterações em contexto de prediabetes. O intestino como órgão primordial na digestão e absorção dos nutrientes, obriga às células intestinais ajustarem o seu mecanismo face à dieta. As VE-intestinais vão conter mensagens que refletem estas alterações transportando-as para o fígado onde o seu conteúdo vai ser depositado. Visto haver grande acumulação de triglicéridos no fígado dos animais injetados, uma hipótese é que as VE-intestinais estejam a transportar lípidos, provenientes da dieta, do intestino para o fígado. Contudo, precisamos de mais dados para poder tirar essas conclusões. Finalmente, com este trabalho destacamos o impacto da dieta nas VE-intestinais e no papel que estas pequenas vesiculas podem ter como portadores de conteúdos funcionais, dos quais destacamos os lípidos, tanto em contexto de doença como de saúde. Western-style diet is a leading cause of metabolic diseases, specifically type 2 diabetes (T2D). T2D is a systemic disease that cannot be seen from the perspective of one only single organ affected. While the liver is a fundamental player in global glucose and lipid metabolism; experimental evidences show that rearrangements of gastro-intestinal anatomy can directly affect glucose homeostasis, and not only through weight loss. In particular, metabolic surgery, initially designed to promote weight loss, can significantly improve glucose homeostasis more effectively than any known pharmaceutical or behavioural methodology, causing total remission of T2D. Therefore, understanding the importance of the intestine as a metabolically active organ is crucial for the development of novel therapies to improve metabolic health. A wide variety of circulating factors, including hormones, cytokines and chemokines work together to orchestrate the systemic response of metabolic organs to diet composition. In the last few years, a new organismal communication mode has emerged. This novel type of systemic communication is mediated by extracellular vesicles (EVs) produced via the multivesicular endosomal pathway and released by every cell. EVs are of great interest because they have the capacity to carry genetic and protein cargoes inside its membranes, along the organism. The high level of technological advance we have nowadays, both in equipment and methods of analysis, enables the detailed characterization of every protein in the cell and in the EVs. (...)