Scalable platform for the expansion of human mesenchymal stem/stromal cells under dynamic conditions

Francisco António Guilherme Moreira

Informações chave

Autores:

Francisco António Guilherme Moreira (Francisco António Guilherme Moreira)

Orientadores:

Joaquim Manuel Sampaio Cabral (Joaquim Manuel Sampaio Cabral); Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva (CLÁUDIA ALEXANDRA MARTINS LOBATO DA SILVA- Investigadora)

Publicado em

11/12/2018

Resumo

Nas últimas décadas, as células estaminais/estromais do mesênquima (MSC) emergiram como um produto celular promissor devido ao seu potencial de aplicação clínica. Devido às suas propriedades únicas, estas células podem ser usadas para tratar doenças do foro imunológico, cicatrização de feridas, aplicações em engenharia de tecidos, entre outras. No entanto, um dos maiores desafios reside no facto dos sistemas de cultura tradicionais não conseguirem alcançar o número de células necessário para a sua implementação clínica. Para além da medula óssea, a primeira e mais bem estudada fonte celular de MSC, o cordão umbilical e tecido adiposo têm sido cada vez mais utilizados para ultrapassar as limitações de um método de colheita invasivo e o baixo rendimento na obtenção de MSC a partir da medula óssea. Não obstante, a necessidade de uma plataforma que seja reprodutível e facilmente escalável permanece um dos principais desafios. O principal objectivo desta tese foi o estabelecimento de uma cultura dinâmica tridimensional que possa ser escavável para uma plataforma automatizada e totalmente controlada, que permita a expansão de MSC, em particular MSC derivadas de tecido adiposo (AT), sob condições sem componentes de origem xenogénica (xeno-free). Neste sentido, duas metodologias foram utilizadas: (i) cultura de MSC em agregados, chamados esferóides, cultivados como estruturas 3D, e (ii) cultura de MSC em micropartículas (microcarriers) que se mantêm em suspensão disponibilizando superfície de adesão para que células possam expandir. Em cultura sob o formato esferóides, as MSC não proliferaram, tanto em condições estáticas como dinâmicas. Estas estruturas 3D foram caracterizadas quanto à sua capacidade de agregar, reprodutibilidade, fonte celular e tamanho. Foram testados diferentes meios de cultura, densidades celulares e agitações com o objectivo de beneficiar a expansão, mas sem sucesso. Com o objectivo de estabelecer uma plataforma com microcarriers para a expansão eficiente de AT MSC, foi feita uma triagem em relação a diferentes microcarriers. Após essa selecção, optimizou-se a cultura dinâmica em spinner flask. A comparação entre StemPro®, um meio xeno-free já estabelecido, com meio suplementado com lisado plaquetário humano (hPL) ou soro AB humano (hAB), demonstrou que a utilização dos suplementos de origem humana promovia a adesão celular, assim como a densidade celular máxima. Foram também optimizadas estratégias de revestimento dos microcarriers, regimes de alimentação e inóculo com o objectivo de progredir para um bioreactor com automatação e controlo. Por fim, dois sistemas de bioreactor foram testados para implementar as optimizações feitas em spinner flask. Em conclusão, esta tese procurou demonstrar a importância da implementação de uma cultura dinâmica 3D para a expansão de MSC e identificar quais os passos que podem ser seguidos para optimizar e implementar plataformas de cultura escaláveis capazes de corresponder às necessidades do sector das terapias celulares. Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) have emerged as a promising cellular product with huge potential for clinical applications. Due to their unique properties, these cells can be applied in the treatment of immune diseases, wound healing and even used for tissue engineering, among others. However, one of the major hurdles is that traditional culture systems are unable to meet the cell doses needed for clinical implementation. Beside bone marrow, the primary and most well studied source, umbilical cord and adipose tissues have been progressively approached with the objective of overcoming the drawbacks of invasiveness and low yield of MSC obtained through bone marrow. Nonetheless, the need for a reproducible and scalable platform, that allows ex-vivo expansion in a xeno(geneic)-free manner, remains indispensable. The main objective of this thesis was to establish a three-dimensional dynamic culture that could be scaled into a fully controlled and automated platform, for the expansion of human MSC, in particularly adipose tissue-derived (AT) cells, under xeno-free conditions. To this end, two main approaches were followed: (i) MSC cultivated as aggregates, known as spheroids, that could undergo culture as a 3D structure in a scaffold-free environment, and (ii) MSC cultivated on microparticles placed in suspension, which offer surface area for adherent cells to expand, referred to as microcarriers. Spheroids were found to be unable to support MSC expansion in both static and dynamic conditions tested. These 3D structures were characterized in regard to their assembly reproducibility, cell source and size. Different media, cell density and agitation were tuned with the objective of improving cellular proliferation, but with no success. The need to establish a microcarrier-based platform for efficient expansion of AT MSC led to an initial screening of the available microcarriers. After careful selection of appropriate microcarrier, dynamic culture was optimized using a spinner flask platform. In comparison to StemPro®, a well-established xeno-free medium for human MSC, a human platelet lysate (hPL) supplement (UltraGRO™) and an in-house produced human AB serum (hAB) showed to improve culture conditions in regard to cell adhesion efficiency and maximal cell density attained. Coating strategies, feeding regiments and initial cell densities were optimized with the objective of translation to a higher scale bioreactor. Lastly, two automated and fully controlled bioreactors were used to implement the optimizations attained in the spinner flask system. In conclusion, throughout this thesis it was emphasised the importance of a 3D dynamic culture for MSC expansion, having identified what steps must be taken to optimize and implement a scalable culture system capable of meeting the needs of the cellular therapy sector.