Integrative platforms for downstream processing and detection of viral particles

Maria João Cardoso Jacinto

Informações chave

Autores:

Maria João Cardoso Jacinto (Maria João Cardoso Jacinto)

Orientadores:

Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros (Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros), Ana Margarida Nunes de Mata Pires de Azevedo (Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo), Richard C. Willson

Publicado em

07/03/2019

Resumo

Os vírus são as formas biológicas mais abundantes na Terra. Estes produtos biológicos são principalmente conhecidos pela sua patogénese viral, processo onde um vírus infecta o seu hospedeiro-alvo, originando consequências moleculares e celulares. No entanto, partículas virais também podem ser encaradas como agentes biomédicos, nomeadamente partículas semelhantes a vírus (VLPs) - nanopartículas biológicas, expressas por sistemas de expressão recombinantes, compostas por proteínas estruturais virais que espontaneamente se aglomeraram na forma de partícula viral sem conter o material genómico viral. Devido à exposição repetitiva de epitopos, a aplicação mais direta de VLPs é o seu uso como vacinas contra o vírus do qual foram derivados, fornecendo uma alta resposta imunogénica. VLPs podem também ser sistemas de exposição de outros antígenos. Outra possibilidade são os bacteriófagos, também conhecidos como fagos, que se tratam de partículas virais que apenas infectam bactérias. Devido ao estreito leque de hospedeiros atacados por um bacteriófago específico (frequentemente composto por um subconjunto de estirpes de uma única espécie bacteriana), estas partículas virais têm sido consideradas como agentes antibacterianos. A sua possível aplicação direta em tecidos vivos, sem agredir o meio circundante mas apenas o seu hospedeiro alvo, assim como os seus modos de ação que não são afectados pelos mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos, demonstram a toxicidade seletiva do bacteriófago e o seu potencial como um agente biológico antibacteriano alternativo. Nas últimas décadas, à medida que as partículas virais começaram a ser usadas como agentes biomédicos, os procedimentos de produção de vírus e partículas virais foram otimizados, levando a maiores rendimentos e volumes de produção. Assim, o processamento a jusante, onde a recuperação e purificação do produto biológico alvo das impurezas e outras partículas relacionadas com o vírus, como proteínas livres, partículas virais incompletas, etc., é alcançado, tem se tornado um factor importante na busca de um processo com alta produtividade e menor custo. Nesta tese foram desenvolvidos dois casos de estudo de purificação de partículas virais. Como os sistemas aquosos de duas fases (ATPS) são uma técnica de purificação à base de água e, portanto, biocompatível pelas suas baixas tensões interfaciais, retenção da atividade biológica e potencial efeito estabilizador das proteínas por acção de alguns polímeros, foi estudado o desempenho desta técnica, tanto em ‘batch’ em escala de mL como em contínuo à microescala para a recuperação de VLPs recombinantes do vírus da imunodeficiência humana (HIV) do sobrenadante de células do ovário de hamsters chineses (CHO). Noutro caso de estudo de purificação, líquidos iónicos poliméricos (PILs) foram estudados tanto em estudos de adsorção/eluição como em modo de operação cromatográfica para o desenvolvimento de uma nova matriz de separação para purificação produtos biológicos, nomeadamente para o bacteriófago M13, que foi usado como modelo viral. Em relação à detecção viral, os métodos tradicionais como microscopia eletrônica, ELISA e PCR apresentam algumas desvantagens significativas, como a necessidade de pessoal altamente treinado, a instrumentação dispendiosa, o tempo dispensado e a utilização de equipamentos de laboratório. Assim, tem sido considerado como um grande desafio a capacidade de criar ferramentas de diagnóstico com as mesmas características de desempenho e garantia de qualidade que métodos laboratoriais, mas num formato mais amigável ao utilizador final/paciente. Nesta tese foram desenvolvidos dois casos de estudo de detecção de partículas virais. Nanopartículas magnéticas foram exploradas como ferramentas de multitarefas (captura e concentração do alvo a detectar, e repórter do teste) para atingir um baixo limite de detecção de um ensaio de fluxo lateral (LFA) para detecção de Norwalk. Noutro caso de estudo de detecção viral, e ao reconhecer as propriedades intrínsecas do ATPS combinadas com a versatilidade, baixo custo e facilidade de uso e preparo, que podem ser escalonáveis pelo processamento paralelo por máquinas automáticas de manipulação de líquidos, foi desenvolvido o primeiro biosensor no qual os ATPS desempenham o papel principal, explorando a sua capacidade de mudar a partição de um repórter de afinidade quando a partícula viral a detectar está presente. Viruses are the most abundant biological forms on Earth. These biological products are mainly known by its viral pathogenesis, which is the process where a biological virus infects its target host, leading to molecular and cellular level consequences. However, viral particles can also be faced as biomedical, namely Virus Like Particles (VLPs) - biological nanoparticles, expressed by recombinant expression systems, composed by viral structural proteins that spontaneously self-assemble into viral particle shape without containing the viral genomic material. Due to high density display of epitopes, the most direct application of VLPs is their use as vaccines against the virus from which they were derived, providing a high immunogenic response. VLPs can also be foreign antigen display systems. On another hand, bacteriophages, also commonly known as phages, are viral particles that only infect bacteria. Due to the bacteriophage’s narrow host range (often comprising a subset of strains of a single bacterial specie), they have been considered as antibacterial agents. Its possible direct application to living tissues, without damaging the surrounding environment but only its target host, as well as its action modes not affected by bacterial resistance to antibiotics mechanisms, demonstrate the bacteriophage selective toxicity and its potential as a biological alternative antibacterial agent. In the last decades, when viral particles have been starting to be used as biomedical agents, the virus and viral particles production procedures have been optimized, leading to higher yields and harvest volumes. Thus, the downstream processing, where the recovery and purification of the target biological product from impurities and other virus particle-related, as free proteins, incomplete viral particles, etc., is achieved, has becoming an important factor in the seeking for an overall high productivity and lower process cost. In this thesis, two viral particles purification case-studies were developed. Since aqueous two-phase systems (ATPS) are water-based purification technique, and thus biocompatible by its low interfacial tensions, retention of biological activity and stabilizing effect on proteins by some polymers, it was studied the performance of this technique, both in batch mL scale and in continuous microscale, for the recovery of recombinant Human Immunodeficiency Virus (HIV) VLP from chinese hamster ovary (CHO) cell supernatant. In another different work, polymeric ionic liquids (PILs) were also studied either in adsorption/elution studies or chromatographic operation mode as a novel separation matrix for biological products purification, namely for M13 bacteriophage, which was used as a viral model. Concerning viral detection, traditional methods as electron microscopy, ELISA and PCR, present some important disadvantages as the need of highly-trained personnel, requires expensive instrumentation, and it is time and lab equipment consuming. Thus, it has been considered as a major challenge the ability to create diagnostic tools with the same performance and quality assurance characteristics as in laboratory-based methods but in a more patient/final user friendly format. In this thesis, two viral particles detection case-studies were developed. Magnetic nanoparticles were explored as multi-tasking tools (target capture and concentration, and test reporter) for low limit of detection of a lateral flow assay (LFA) for Norwalk detection. In another viral detection case study, by acknowledging the ATPS intrinsic properties combined with the versatility, environmentally-friendliness, low costs, ease to use and prepare which can even be scalable by parallel processing, it was developed the first biosensor in which the ATPS plays a primary role, by exploring its ability to switch the partition of an affinity reporter when the target viral particle is present.