Monolayer Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSC) into Cardiomyocytes

Tânia Daniela Calaveiras Baltazar

Key information

Authors:

Tânia Daniela Calaveiras Baltazar (Tânia Daniela Calaveiras Baltazar)

Supervisors:

Joaquim Manuel Sampaio Cabral (Joaquim Manuel Sampaio Cabral); Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo (Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo)

Published in

10/15/2013

Abstract

This work aims at the establishment of a robust protocol for the monolayer differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSC) into cardiomyocytes in serum-free conditions for future large scale production of human cardiomyocytes. The efficiency of several protocols was evaluated in different hiPS cell lines and the optimal conditions to induce cardiac differentiation based on the addition of growth factors (Activin A and BMP4) and/or small molecules (CHIR99021 and IWP4) were studied. Quantification of cardiac differentiation efficiency via growth factors addition in iLB-c1-30m-r12 cells showed low expression of late cardiac markers cTnT and α-actinin (less than 3%). However, cardiac differentiation via small molecule modulators of Wnt signaling proved to efficiency differentiate iPS-DF6-9-9T.B cells into cardiomyocytes, when adding 5 µm CHIR to the culture on day 0, showing up to 70% α-actinin+ cells after 18 days of differentiation. Additionally, the final yield of hiPSC-Cardiomyocytes produced based on the small molecule modulators of Wnt signaling protocol was increased by three fold by re-plating cells into laminin, fibronectin and vitronectinon in the 6th day of differentiation and adding 10 ng/mL of VEFG on day 6. This method proved to efficiently produce an actively beating monolayer of cardiomyocytes, expressing up to 73% α-actinin+ cells. The use of biochemically defined coatings in combination with the use of small molecules to direct cardiac differentiation of hiPSC turns this culture system much more cost-effective which gives this method a unique potential for the large scale production of human cardiomyocytes for future clinical purposes. O trabalho experimental desenvolvido no âmbito desta tese teve como objectivo o estabelecimento de uma plataforma quimicamente definida, livre de contaminantes xenogénicos e robusta para permitir a diferenciação cardíaca de hiPSC em monocamada, para futura produção em larga escala de cardiomiócitos humanos e potencial uso no screening de novos fármacos e em Medicina Regenerativa. Três linhas de hiPSC (iLB-c1-30m-r12, iPS-DF6- 9-9T.B e iPS-DF19-9-11T.H) foram caracterizadas para assegurar a estabilidade da expressão de marcadores de pluripotência antes dos estudos de diferenciação cardíaca. A eficiência de vários protocolos recentemente publicados para a diferenciação cardíaca de hiPSC foi avaliada em diferentes linhas e as condições óptimas para indução de comprometimento cardíaco com base na adição de factores de crescimento (Activina A e BMP4) e/ou pequenas moléculas (CHIR99021 e IWP4) foram estudadas. A quantificação da eficiência de diferenciação cardíaca via adição de factores de crescimento em células iLB-c1-30m-r12 revelou baixa expressão dos marcadores cardíacos tardios cTnT e α-actinina (inferior a 3%). Contudo, diferenciação cardíaca via pequenas moléculas modeladoras da sinalização Wnt demonstrou eficiente diferenciação de células iPS-DF6-9-9T.B em cardiomiócitos, ao adicionar 5 µm CHIR à cultura no dia 0, revelando até 70% de células α-actinin+ após 18 dias de diferenciação. Adicionalmente, o rendimento final de cardiomiócitos produzidos a partir de hiPSC foi aumentando em cerca de três vezes através de re-plaqueamento de células diferenciadas ao dia 6 em laminina, vitronectina e fibronectina. A adição de 10 ng/mL de VEGF à cultura apenas no dia 6 de diferenciação, às células re-plaqueadas demonstrou produção eficaz de uma monocamada de cardiomiócitos com batimento activo, expressando até 73% de células αactinin+. O uso de substractos bioquimicamente definidos como a laminna, fibronectina e vitronectina para o comprometimento cardiaco de hiPSC contribui para o estabelecimento de um protocolo de diferenciação cardíaca directa inteiramente livre de contaminantes xenogénicos. Este último em combinação com o uso de pequenas moléculas para a diferenciação cardíaca de hiPSC torna este sistema de cultura muito mais eficiente a nível de custo comparando com protocolos com base na adição de factores de crescimento, o que confere a este método um potencial único para a produção em larga escala de cardiomiócitos humanos para futuras aplicações clínicas.