Bioprocess development for scalable generation of functional liver micro-tissues/organoids from human pluripotent stem cells

Saeed Abbasalizadeh

Informações chave

Autores:

Saeed Abbasalizadeh (Saeed Abbasalizadeh)

Orientadores:

Joaquim Manuel Sampaio Cabral (Joaquim Manuel Sampaio Cabral); Hossein Baharvand

Publicado em

19/01/2021

Resumo

As doenças hepáticas crónicas ainda são consideradas um problema de saúde globalmente negligenciado, uma vez que o transplante de fígado é apenas uma opção disponível para tratamento e altamente limitado, devido à escassez de fígados transplantáveis disponíveis e ao aumento da taxa de prevalência de insuficiência hepática. Para abordar este desafio, tem havido um esforço científico e tecnológico global de modo a desenvolver terapias alternativas e regenerativas para respoder a essa necessidade médica atualmente negligenciada. Uma das tecnologias regenerativas mais promissoras é a "a medicina de organóides" e a obtenção escalonável de organóides hepáticos funcionais / vascularizados a partir de fontes celulares disponíveis, como células estaminais pluripotentes humanas, para potencial transplante e aplicação terapêutica. No entanto, a maioria dos protocolos estabelecidos para a obtenção funcional de organóides hepáticos tem sido em pequena escala ou com problemas de escalabilidade para produção em larga escala e ampla aplicação clínica. Nesta tese, desenvolvemos um protocolo robusto e um processo a montante para produção escalonável de organóides hepáticos funcionais do tipo fetal a partir de células estaminais pluripotentes humanas em biorreatores agitados, que incluem hepatócitos e glóbulos vermelhos, otimizando os principais parâmetros do bioprocesso durante o processo de diferenciação hepática integrado. Os organóides gerados expressam genes marcadores específicos do fígado, préformando as principais funções metabólicas do fígado (ou seja, secreção de albumina, produção de uréia, captação de indocianina verde (ICG) e LDL e armazenamento de glicogénio) e alta atividade do citocromo P450 induzível Paralelamente, para produzir organóides hepáticos complexos e altamente funcionais de maneira escalável, estabelecemos também, uma plataforma escalável para obtenção de endoderme hepático, células estaminais mesenquimais e células endoteliais a partir de células estaminais pluripotentes humanas, como fontes celulares necessárias para a geração escalonável de gomos hepáticos vascularizados funcionais através de cultura e autoorganização. Um sistema microfluídico escalável foi também estabelecido para a geração contínua de gomos no fígado em gotículas biodegradáveis 4-armPEG-MMP degradable peptide e PGA. Os organóides hepatobiliares vascularizados auto-organizados foram gerados após a otimização das condições de co-cultura e a transferência de organóides para a cultura em suspensão dinâmica 3D para uma maior maturação. Os organóides hepatobiliares vascularizados apresentaram funções essenciais do fígado, como a expressão de genes marcadores específicos do fígado, a pré-formação das principais funções metabólicas do fígado e o metabolismo induzido por medicamentos próximo ao fígado adulto. Assim, estas plataformas podem ser úteis para a produção em larga escala de organóides do fígado humano e uma fonte valiosa e ilimitada para triagem de medicamentos e desenvolvimento in vitro de tecidos / órgão do fígado. Chronic liver diseases are still considered as an unmet medical need and a globally neglected health problem since liver transplantation is only available option for treatment, but highly limited due to shortages of available transplantable livers and increasing prevalence rate of liver failure. To cope with this challenge, there is a global scientific and technological effort to develop alternative and regenerative therapies to address this currently unmet medical need. One the most promising regenerative technologies is “Organoid medicine” and scalable generation of functional/vascularized liver organoids from readily available cell sources such as human pluripotent stem cells for potential transplantation and therapeutic application. However, most of the established protocols for functional liver organoid generation have conducted in small scale or suffering scalability issues for large scale production and widespread clinical application. Here, we have developed a robust protocol and upstream process for scalable production of functional fetal-like liver organoids from hPSCs in stirred suspension bioreactors comprising hepatocytes and red blood cells by optimizing key bioprocess parameters during integrated hepatic differentiation process. Generated organoids expressed liver-specific marker genes, preforming main liver metabolic functions (i.e. albumin secretion, urea production, Indocyanine green (ICG) and LDL uptake, and glycogen storage), and high inducible cytochrome P450 activity. In parallel and to produce complex and highly functional liver organoids in scalable manner, we also established a scalable platform for generation of hepatic endoderm, mesenchymal stem cells and endothelial cells from hPSCs as required cell ingredients for scalable generation of functional vascularized liver buds through co-culture and self-organization. A scalable microfluidic system has also established for continuous generation of liver organoids in biodegradable 4-armPEG-MMP degradable peptide or PGA fabricated core and shell microcapsules. Self-organized vascularized hepatobiliary organoids have been generated after optimizing co-culture condition and transferring organoids to 3D dynamic suspension culture for further maturation. The vascularized hepatobiliary organoids after 7 days of maturation showed key functional of liver such as expressing liver-specific marker genes, preforming main liver metabolic functions and induced drug metabolism close to adult liver. The established platforms might be useful for mass production human liver organoids and provide a valuable and unlimited source for drug screening, organoid medicine, and in vitro development of liver tissues/organ.