Biomanufacturing of non-viral protein nanocages

Jorge Fernandes da Silva João

Key information

Authors:

Jorge Fernandes da Silva João (Jorge Fernandes da Silva João)

Supervisors:

Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres (Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres)

Published in

05/26/2025

Abstract

As nanocages proteicas não-virais (NVPNs) são arquiteturas altamente ordenadas à escala nanométrica, geralmente formadas pela auto-organização de vários monómeros iguais ou diferentes em estruturas simétricas com dimensões e morfologias variadas. As características intrínsecas das nanocages proteicas, que as tornam muito atrativas como nanomaterial biológico, incluem uma razão superfície/volume elevada, multifuncionalidade, facilidade de modificação ou manipulação genética ou química, elevada estabilidade, mono-dispersibilidade e biocompatibilidade. Várias aplicações em diversas áreas científicas têm sido estudadas, desde a biotecnologia à biomedicina, que demonstram que estas nanocages podem ser uma ferramenta promissora e interessante. O desenvolvimento deste tipo de aplicações de NVPNs implica a obtenção de elevadas quantidades de nanoestruturas puras e com a montagem correta. Torna-se assim necessário dispor de processos de bio-manufatura eficazes que permitam transformar as nanocages proteicas em bioprodutos reais. Para além disso, esses processos devem ser suportados por técnicas analíticas adequadas ao controlo de qualidade e à caracterização da estrutura e função biológica das nanocages. O principal objetivo deste trabalho é desenvolver processos escaláveis e eficientes para a biomanufatura de NVPNs. Dois modelos de nanocages proteicas, um natural e outro artificial, foram utilizados ao longo do trabalho. Primeiramente, foi implementada a produção de ambos os modelos de nanocages em células de Escherichia coli, tendo depois sido esta considerada como método de referência para a manufatura. Adicionalmente, a produção foi também estabelecida em células de Vibrio natriegens, seguida de um processo de otimização de diversas condições relevantes. Posteriormente, foi desenvolvida uma estratégia de purificação utilizando as NVPNs produzidas em E. coli e V. natriegens. O processo baseou-se em abordagens cromatográficas que foram otimizadas de modo a obter um produto altamente purificado. As estruturas finais das nanocages proteicas expressas nas duas bactérias foram analisadas e caracterizadas utilizando várias técnicas analíticas, nomeadamente ensaios de microscopia e de espectroscopia ótica. Non-viral protein nanocages (NVPNs) are highly ordered, nanometer scale architectures, which are typically formed by homo- or hetero-self-assembly of multiple monomers into symmetric structures with different dimensions and morphologies. The intrinsic characteristics of protein nanocages make them very attractive as a biological nanomaterial, and include a high surface/volume ratio, multifunctionality, ease to modify or manipulate genetically or chemically, high stability, monodispersibility, and biocompatibility. Several applications have been implemented in a wide range of scientific areas from biotechnology to biomedicine, showing that these nanocages can be a promising and interesting tool. The development of such applications for NVPNs requires large amounts of pure and well-folded assemblies. Consequently, the availability of more effective biomanufacturing processes is needed to transform protein nanocages into valuable bioproducts. Moreover, these manufacturing processes should be supported by analytical techniques adequate for the quality control and characterization of the structure and biological function of nanocages. The main objective of this work is the development of scalable and efficient processes for the biomanufacturing of NVPNs. Two models of this type of protein nanocages, one natural and the other artificial, were used throughout the work. Firstly, the production of both model nanocages in Escherichia coli cells was set up and used as a benchmark manufacturing method. Additionally, the same production was performed in the alternative bacterial host Vibrio natriegens, followed by an optimization process of several relevant conditions. Afterwards, a purification strategy was developed using the NVPNs produced both in E. coli and V. natriegens. The process was based on chromatographic approaches, which were optimized to obtain a highly purified product. The final structure of the protein nanocages synthesized in both bacteria was studied and characterized using a range of analytical techniques, namely microscopy and optical spectroscopy assays.