Deepening the role of CgHaa1- and CgPdr1- pathways in stress resilience and pathogenesis of Candida glabrata to foster new antifungal treatments

17/06/2022

O aparecimento de isolados clínicos de Candida glabrata resistentes aos antifúngicos atualmente disponíveis é um dos fatores mais relevantes na determinação do sucesso do tratamento dos doentes com infeções causadas por esta espécie, tal leva à necessidade de identificar medicamentos alternativos adequados e novos alvos terapêuticos diferentes dos visados pelos antifúngicos existentes. Os fatores de transcrição envolvidos na resposta ao stress ambiental (incluindo stress causado pela presença de antifúngicos) apresentam-se como um conjunto interessante de possíveis alvos considerando o seu papel essencial na regulação das respostas de tolerância adequadas. Igualmente importante, é o facto de a inibição da sua atividade poder resultar num amplo impacto na célula, uma vez que pode afectar em simultâneo a expressão de múltiplos genes, incluindo os que poderiam ser necessários para a sobrevivência na presença do agente de stresse. Esta tese foca-se em detalhar aspetos moleculares de duas vias transcriptómicas controladas por dois fatores de transcrição, o CgPdr1, um fator central na resposta a múltiplas drogas em diferentes espécies de leveduras, e o CgHaa1, identificado como um fator determinante na tolerância ao ácido acético em algumas espécies, incluindo em C. glabrata. É espectável que ao detalhar ao pormenor os mecanismos moleculares que regulam o funcionamento das vias de transcrição CgPdr1 e CgHaa1 seja possível clarificar a possível utilização de ambas vias regulatórias como alvos no desenvolvimento de novos tratamentos anti-Candida. No caso específico do CgPdr1, considerando o seu papel proeminente na aquisição de resistência aos azóis em estirpes clínicas, aspeto bem escrutinado nesta tese, a sua posterior caracterização pode também abrir caminho para o desenvolvimento de ferramentas que possam facilitar o diagnóstico precoce de estirpes resistentes, uma questão importante uma vez que se verificou que a terapia apropriada consoante a resistência do isolado clínico desempenha um papel importante na determinação das taxas de mortalidade de pacientes que sofrem de candidíase invasiva. Até à data, foram detalhados vários mecanismos moleculares subjacentes à tolerância aos azóis em C. glabrata, incluindo o papel proeminente desempenhado pelo CgPdr1, no entanto, a maioria deste conhecimento foi obtido através do uso de estirpes laboratoriais sem escrutinar o envolvimento na aquisição do fenótipo de resistência em estirpes clínicas. Neste sentido, um dos objetivos desta tese é o foco do estudo de resistência em estirpes clínicas, não só aquelas recuperadas de locais estéreis (geralmente implicadas em infeções invasivas) mas também em estirpes comensais, isoladas de locais não estéreis onde a C. glabrata pode prosperar como parte do micro(mico)bioma comensal. Utilizando análises comparativas transcriptómicas e genómicas de estirpes suscetíveis e resistentes a azóis, foi possível demonstrar que a aquisição de mutações na sequência de codificação de CgPDR1 resultando na hiperativação deste regulador é o mecanismo de resistência mais comumente encontrado, tendo sido possível identificar novas variantes que não foram previamente descritas: CgPdr1K274Q, CgPdr1I392M e CgPdr1I803T. Para compreender melhor como o impacto destas três novas mutações hiper-activadoras na atividade bioquímica do CgPdr1, foi estudado o seu impacto na estrutura tridimensional da proteína (utilizando modelação in silico) juntamente com a análise de possíveis alterações da ligação direta ao conjunto de promotores e interactoma in vivo. No conjunto, os resultados obtidos nesta tese confirmam que a variante hiper-ativa do CgPdr1K274Q reconhece in vivo o mesmo conjunto de promotores CgPdr1 do tipo selvagem, embora mostre uma maior capacidade de induzir a expressão de um conjunto de genes alvo. Foi também possível identificar um conjunto de proteínas que interagem com o tipo selvagem e com a variante K274Q do CgPdr1, mas serão necessários mais estudos para compreender se possíveis diferenças de interação com ambas as variantes são responsáveis pelas diferentes capacidades demonstradas das duas proteínas induzirem a expressão dos genes alvo. Após ter sido demonstrado que CgHaa1 é necessário para a máxima tolerância e resposta a ácido acético em C. glabrata, nesta tese foi abordada a clarificação da rede transcriptómica controlada por este factor de transcrição e um possível envolvimento deste sistema na formação de biofilme e da patogénese desta espécie. Usando a metodologia de ChIP-seq foi possível demonstrar que o CgHaa1 se liga diretamente a 22 genes in vivo, alguns deles (por exemplo, CgTPO3, CgHRK1, CgYGP1) com ortólogos em S. cerevisiae que foram previamente demonstrados ser importantes para conferir proteção contra o ácido acético. Apenas 20% do regulão direto de CgHaa1 identificado é conservado quando comparado ao de S. cerevisiae, o que indica uma divergência notável destas redes transcripcionais em ambas as espécies. A evolução da rede direta de Haa1 em C. glabrata pode ser o resultado do reconhecimento de um novo elemento cis identificado in silico, cuja ligação pelo fator de transcrição requer confirmação adicional. Os resultados obtidos demonstram também que o CgHaa1 é necessário para a máxima aderência e formação de biofilme de C. glabrata tanto em superfícies bióticas como abióticas. A expressão de CgHaa1 e dos seus genes alvo, CgAWP12, CgAWP13, CAGL0K10164g, CAGL0I07249g, CAGL0E03740g e CAGL0G05632g, foi também demonstrada ser importante para maximizar a virulência de C. glabrata no modelo de lagarta da traça-de-cera Galleria mellonella, o que é de particular interesse uma vez que aumenta as funções biológicas deste sistema para além da resposta ao ácido acético a pH baixo. The emergence of Candida glabrata strains resistant to currently used antifungals is one of the more relevant factors determining the outcome of patients suffering from infections caused by this species pushing the need of identifying suitable alternative drugs and new targets different from those targeted by current antifungals. Transcription factors involved in response to environmental stress (including those that respond to the presence of antifungals in the environment) present themselves as an interesting set of possible targets considering their essential role in mounting appropriate tolerance responses. Also of importance, is the fact that the inhibition of their activity can result in a wide impact in the cell since it can affect, simultaneously, the expression of multiple genes, including those that could be required for survival in the presence of the stressor. This thesis is focused on detailing molecular aspects of two pathways controlled by two transcription factors, CgPdr1, a pivotal player in response to drugs across different Yeast species, and CgHaa1, demonstrated to serve as a determinant of tolerance to acetic acid in some species, including C. glabrata. It is expected that the detailing of the molecular mechanisms by which these CgPdr1- and CgHaa1- dependent pathways function, can help to foster their possible use as targets in the development of new anti-Candida treatments. In the specific case of CgPdr1, considering its prominent role in the acquisition of resistance to azoles in clinical strains, an aspect that is well scrutinized in this thesis, its further characterization may also pave the way for the development of tools that can facilitate the early diagnosis of resistant strains, a pressing issue since appropriate antifungal treatment according to the clinical isolate resistance profile has been found to play an important role in determining mortality rates of patients suffering from invasive candidiasis. A lot of knowledge has been gathered concerning molecular mechanisms underlying tolerance to azoles in C. glabrata, but most of it was gathered in laboratory strains without scrutinizing involvement in the acquisition of the resistance phenotype in clinical strains. In this sense, one of the objectives of this thesis was to focus on clinical strains, not only those retrieved from sterile sites (usually more focused by being implied in invasive infections) but also commensal strains, retrieved from non-sterile sites where C. glabrata can thrive as part of the commensal micro(myco)biome. Using comparative transcriptomic and genomic analyses of azole susceptible and resistant strains, it was possible to demonstrate that the acquisition of mutations in the coding sequence of CgPDR1 resulting in hyper-activation of this regulator is the most commonly found resistance mechanism, being possible to identify new variants that were not previously described: CgPdr1K274Q, CgPdr1I392M and CgPdr1I803T. To further understand how the impact of these three novel hyper-activating mutations affect the biochemical activity of CgPdr1, their impact in the tridimensional structure of the protein was studied (using in silico modelling) along with possible changes in the set of promoters and interactors directly bound in vivo. Altogether the results obtained in this thesis confirm that hyper-active CgPdr1K274Q variant recognizes in vivo the same set of promoters recognized by the wild-type CgPdr1, although they show enhanced capacity to induce expression of a set of target genes. It was possible to identify a set of proteins interacting with wild-type and with the K274Q variant of CgPdr1,but further studies will be required to understand whether these differences in the interaction to both variants are responsible for the detected different capabilities of the two proteins to induce target gene expression.

Autores da comunidade :

• 

  S

  Sara Barbosa Salazar

  ist165783

Orientadores desta instituição:

• 

  N

  Nuno Gonçalo Pereira Mira

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Doutoramento em Biotecnologia e Biociência

- Ciências Biológicas

Palavras-chave

• resistência a azóis
• CgPdr1- e CgHaa1 - rede de transcrição
• resposta a stress ambiental
• transcriptómica e genómica comparativa
• Candida glabrata
• azole resistance
• CgPdr1- and CgHaa1- transcriptional regulation
• response to environmental stress
• comparative transcriptomics and genomics

- Inglês

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