Synthetic biology approaches to foster Yeasts as hosts for the production of carboxylic acids and their derivatives: emphasis on levulinic and itaconic acids

Ana Isabel de Vila-Santa Braga Campos

Key information

Authors:

Ana Isabel de Vila-Santa Braga Campos (Ana Isabel de Vila-Santa Braga Campos)

Supervisors:

Nuno Gonçalo Pereira Mira (Nuno Gonçalo Pereira Mira); Frederico Castelo Alves Ferreira (Frederico Castelo Alves Ferreira); Kristala Jones Prather

Published in

04/16/2021

Abstract

O aumento da procura de moléculas plataforma, necessárias para a produção em massa de produtos como de roupas, peças de automóvel e cosméticos, entre outros, e o facto destas moléculas serem derivadas de processos petroquímicos tem incitado uma corrente de investigação focada no desenvolvimento de processos mais ecológicos de produção destas moléculas. Esta tese encontra-se dentro desse âmbito focando a sua atenção no desenvolvimento de processos que permitam a obtenção dos ácidos levulínico, itacónico e metacrílico, por fermentação microbiana em leveduras. Ao passo que no caso do ácido itacónico, a sua produção em micróbios já se encontrava descrita e o que se descreve nesta tese se centra no melhoramento do processo através da engenharia de novos hospedeiros microbianos, o ácido levulínico e o ácido metacrícilico constituem moléculas denominadas new-to-nature uma vez que não fazem parte das redes metabólicas conhecidas de micróbios. O potencial dos ácidos levulínico, itacónico e metacrílico enquanto moléculas plataformas bem como as estratégias experimentais que podem ser usadas para implementar a produção por via microbiana de moléculas new-tonature, essencialmente baseadas em abordagens de biologia sintética moderna suportada por análises computacionais, encontram-se descritas no capítulo 1 desta tese. No capítulo 2 é feita uma descrição geral do trabalho executado durante esta tese. No terceiro capítulo descreve-se, pela primeira vez, a implementação de uma estratégia para selecionar vias biosintéticas com maior potencial para a produção de ácido levulínico em micróbios, resultando na descrição de 4 novas vias biosintéticas de ácido levulínico, através dos precursores ácido δ-aminolevulínico, glutamato-1-semialdeído, ácido 3-oxoadípico e ácido 5-aminovalérico. Destas vias, a que assenta na utilização do precursor δ-aminolevulínico e das enzimas 8-amino-7-oxononanoato transaminase e diaminopropiónico amónia liase foi selecionada para posterior validação experimental sendo esses resultados descritos no capítulo 4 desta tese. Para essa validação experimental tentou-se confirmar a capacidade das enzimas escolhidas na abordagem in silico catalisarem as reações sintéticas identificadas, tendo sido possível confirmar que a enzima 8-amino-7-oxononanoato transaminase leva à conversão de ácido δ-aminolevulínico em ácido 4,5-diaminovalérico, embora em quantidades pouco significativas, sugerindo que será necessário no futuro intervenções (por exemplo através de engenharia enzimática) que permitam aumentar a atividade desta enzima e, consequentemente, o aumento deste passo. Durante o tempo que decorreu o trabalho experimental desta tese não foi possível confirmar se o segundo passo de reação, que promove a conversão de ácido 4,5- diaminovalérico em ácido levulínico, poderia ser catalisado pela enzima identificada in silico, sendo este um aspeto que terá que ser analisado de futuro. Outra abordagem que foi usada para aumentar o rendimento da via selecionada constituiu na engenharia de uma estirpe de S. cerevisiae que sobre produza ácido δ-aminolevulínico, tendo-se para isso tentado promover o silenciamento do gene essencial HEM2, que codifica a enzima ácido δ-aminolevulínico desidratase, envolvida na conversão deste precursor em porfobilinogénio, através de um sistema dependente de doxiclicina. Apesar da estirpe obtida apresentar uma produção total mais baixa que a selvagem, a produção específica de D-ALA é superior ao fim de 48 horas, embora não tenha sido possível confirmar de forma inequívoca que esse fenótipo se deve à redução da expressão do gene HEM2. Uma estratégia semelhante à utilizada para fazer a prospeção de vias para a produção de ácido levulínico foi usada para encontrar vias candidatas à produção de ácido metacrílico, resultando na seleção de 6 potenciais vias (descritas no capítulo 5). Destas, 5 já tinham sido previamente descritas, iniciando-se pelo glutamato, valina ou timina, e uma não tinha sido descrita previamente, iniciando-se pelo glioxilato. De entre as várias possibilidades encontradas considerou-se mais promissora a possibilidade de obter ácido metacrílico por descarboxilação direta do ácido mesacónico através de duas descarboxílases, AtCad1 de Aspergillus terreus e ACMSD de Pseudomonas fluorescens. A realização de ensaios enzimáticos in vitro usando extratos enriquecidos nestas duas enzimas não permitiu demonstrar que as mesmas sejam capazes de promover a conversão desejada, embora seja de realçar que os métodos usados para a deteção de MAA podem não ter sido suficientemente sensíveis para detetar eventuais quantidades mínimas produzidas. Finalmente, no capítulo 6 são descritos os resultados obtidos quanto ao desenho das partes genéticas que podem ser utilizadas para o desenho de um sensor de ácido itacónico em S. cerevisiae, utilizando a sua rede genética endógena, e resultando na descoberta de 3 genes responsivos a ácido itacónico (DAL5, MEP2 e TMT1) com uma curva doseresposta linear e 2 possíveis reguladores que podem estar a orquestrar a resposta (Leu3 e Dal81). Para além de permitir o screening rápido e imediato de estirpes de S. cerevisiae com capacidade aumentada para a produção de ácido itacónico, os resultados deste capítulo também forneceram pistas importantes acerca dos mecanismos de toxicidade exercidos pelo ácido itacónico nas células de levedura, um conhecimento que pode ser usado para melhorar a capacidade produtiva destas células. The increasing demand of bulk chemicals, required for the mass production of clothes, automobile parts and cosmetics (among other products), and the fact that these molecules are derived from petrochemical sources has initiated a stream of research focused on the development of greener processes to obtain bulk chemicals, including using fermentation. This thesis is framed in this context, with the main goal of using yeast fermentation to produce itaconic, levulinic and methacrylic acids. While itaconic acid is naturally produced by fungi and the efforts described in this thesis are aimed at improving the already established yeast-based production of this acid, levulinic and methacrylic acids are “new-to-nature” molecules, since these are not found in the metabolism of any organism. In the first chapter of this thesis it is reviewed the potential of the three acids as platform molecules and the main experimental approaches that have been used to establish their bio-based production. The contribution of synthetic biology methodologies and pathway prospecting tools to aid in these tasks is also described. In the second chapter there is an introduction to the work produced during this thesis. In the third chapter a strategy is described to select potential biosynthetic pathways that can be introduced in microbes leading to levulinic acid production, resulting in the description of 4 new levulinic acid biosynthetic pathways, from the precursors δaminolevulínic acid, glutamate-1-semialdehyde, 3-oxoadipic acid and 5-aminovaleric acid. Of these, the pathway relying on the ubiquitous precursor δ-aminolevulínic acid and the enzymes 8-amino-7-oxononanoate transaminase and diaminopropionate ammonia lyase was selected for posterior experimental validation, described in chapter 4 of this thesis. The ability of these enzymes to catalyze the required synthetic reactions was analyzed in vitro, enabling the confirmation that the enzyme 8-amino-7-oxononanoate can catalyze the amination of δ-aminolevulínic acid to 4,5-diaminovaleric acid, although in low amounts, suggesting that future interventions will be required to increase the enzyme’s activity with the non-native substrate, including enzyme engineering. At the time of this work, it was not possible to confirm that the second enzymatic step, entailing the deamination of 4,5-aminovaleric acid to levulinic acid could be catalyzed by the enzyme identified in the in silico work. Another goal in this chapter was improving the pool of this pathway’s precursor, δ-aminolevulinic acid, in S. cerevisiae through the doxycycline-dependent downregulation of HEM2, encoding δ-aminolevulinic acid dehydratase, the enzyme responsible for the conversion of the precursor in porphobilinogen. While the titer obtained with the engineered strain after 48 hours of fermentation is lower than the wild-type strain, the engineered strain presents a higher specific production, which could not be confirmed to be attributed to a lower HEM2 expression. A similar strategy that was used to prospect for pathways for levulinic acid production was also applied to methacrylic acid, resulting in the selection of 6 potential pathways (described in chapter 5). Of these, 5 had been previously described, steaming from glutamate, valine or thymine and one, starting from glyoxylate, had not been previously described. From the pathways described the one entailing the direct decarboxylation of mesaconic acid was selected for further validation, through the action of two decarboxylases: AtCad1 from Aspergillus terreus and ACMSD from Pseudomonas fluorescens. The results obtained from in vitro enzymatic assays using enriched crude cell extracts could not confirm the decarboxylations, although the detection method used (HPLC) may not be sensitive to the concentrations used here. Finally, in chapter 6 it is described a strategy to find genetic parts that can be used to develop an itaconic acid sensor in S. cerevisiae by using its endogenous regulatory network and it was uncovered 3 potential itaconic acid-responsive genes (DAL5, MEP2 and TMT1) with a linear dose-response curve and 2 possible regulators behind the response (Leu3 and Dal81). While these results may open the door for a fast screening methodology of itaconic acid producer strains, these also provide some clues on the mechanism of itaconic acid toxicity in yeast, required to improve the cellular tolerance to this acid.