Ex-vivo gene therapy to improve the regenerative features of human mesenchymal stem/stromal cells (MSC) in a model of limb ischemia

Joana Catarina Onofre Pinto Ferreira Serra

Key information

Authors:

Joana Catarina Onofre Pinto Ferreira Serra (Joana Catarina Onofre Pinto Ferreira Serra)

Supervisors:

Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres (Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres); Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva (CLÁUDIA ALEXANDRA MARTINS LOBATO DA SILVA- Investigadora); Sang Won Han

Published in

06/07/2019

Abstract

As células estaminais mesenquimais (MSC) apresentam um grande potencial na área da medicina regenerativa e terapia celular devido às suas propriedades únicas, incluindo actividade terapêutica através de secreção de factores, potencial imunomodulatório e capacidade de evasão ao sistema imunitário. No entanto, apresentam capacidades de enxerto e sobrevivência limitadas após administração in vivo, sendo necessário desenvolver estratégias para aumentar o seu potencial. Um novo tipo de veículos não virais para engenharia genética – minicírculos - foi estudado para transfectar MSC, aumentando os seus efeitos benéficos. Minicírculos com a proteína terapêutica VEGF sozinha (MC-VEGF) ou em fusão com um gene codificante de um repórter fluorescente – GFP – (MC-VEGF-GFP) foram construídos, produzidos e purificados usando um método inovador e recentemente desenvolvido. O efeito de MC-VEGF foi verificado em MSC da medula óssea (MO), a fonte mais comum e amplamente estudada deste tipo de células. Para determinar o potencial dos minicírculos, estes foram comparados com plasmídeos convencionais (pVAX) contendo a mesma cassete genética (VEGF ou VEGF-GFP). MO-MSC foram inicialmente transfectadas por microporação com vectores VEGF-GFP, de modo a optimizar o processo e depois foram usados vectores apenas com VEGF. A transfeção de MSC com minicírculos levou não só a um aumento na produção de VEGF, reflectido na expressão génica e secreção de proteína, mas também a um melhoramento da actividade angiogénica, observado em ensaios funcionais com células endoteliais. Recentemente, têm vindo a ser exploradas fontes de MSC alternativas à MO, sendo as mais comuns: tecido adiposo (AT) e matriz do cordão umbilical (UCM). Assim, os MC-VEGF foram testados nestas duas fontes e o potencial angiogénico foi avaliado em termos de produção de VEGF e funcionalidade. Após transfecção com minícirculos com VEGF, os níveis de produção de VEGF e a capacidade angiogénica in vitro foi semelhante para as três fontes. Assim, demonstrouse que o protocolo usado para transfecção poderá ser aplicado com sucesso a diferentes fontes de MSC, levando a resultados semelhantes. Por fim, MO-MSC geneticamente modificadas foram testadas em ratinho num modelo de isquemia de membros inferiores no contexto da doença arterial periférica (DAP). A infusão de MSC sobre-expressando levou a um aumento significativo da função muscular nos ratinhos isquémicos. Os resultados obtidos revelaram que a modificação genética de MSC com MC- VEGF poderá ser uma estratégia promissora para tratamento da DAP, especialmente em doentes sem outra opção terapêutica. Mesenchymal stem cells (MSC) hold great promise for regenerative medicine and cell therapy due to their unique properties that include paracrine therapeutic activity, immunomodulatory potential and capacity to evade the immune system. However, they have limited engraftment and survival upon in vivo administration and, thus, strategies to improve their potential need to be developed. Herein, a new type of non-viral vehicles for MSC genetic engineering – minicircles – were studied in order to efficiently transfect and increase beneficial effects of MSC. Minicircles containing the VEGF therapeutic (MC-VEGF) protein alone or in fusion with the reporter green fluorescent protein (GFP) (MC-VEGF-GFP) were constructed, produced and purified using a recently developed innovative method. The effect of VEGF-containing minicircles was first confirmed in bone marrow (BM)-derived MSC, since this is the most commonly and widely studied source of these cells. To assess the potential for MSC engineering, minicircles were compared with conventional plasmid constructs (pVAX) with the same genetic cassette (VEGF or VEGF-GFP). BM-MSC were first transfected with VEGF-GFP vectors using microporation to optimize the overall strategy and then vectors containing only VEGF were used. MSC transfection with minicircles led not only to an increased VEGF production, reflected both by analysis of gene expression and protein secretion, but also to an enhancement in MSC angiogenic activity in vitro as observed in functional assays with endothelial cells. Alternative sources to BM have also been explored in past years, being the most common adipose tissue (AT) and umbilical cord matrix (UCM). So, VEGF-containing minicircles were tested in these two MSC sources and the angiogenic potential was evaluated in terms of VEGF production and functionality. The three sources showed similar VEGF production levels, as well as in vitro angiogenic capacity after transfection with VEGF-encoding minicircles. Hence, the protocol used herein for MSC transfection can be successfully applied to different sources of MSC with similar outcomes. Finally, MSC from BM genetically modified with VEGF-encoding minicircles were tested in a mouse model of hind limb ischemia in the context of peripheral arterial disease (PAD). The infusion of VEGF-overexpressing MSC promoted significant improvements in muscular function of ischemic mice. The results obtained in present thesis revealed that MSC modified with VEGFencoding minicircles could be a promising strategy for the treatment of PAD, especially for the no-option patients.