Elucidating mechanisms of damage-induced stem cell activation in the adult drosophila brain

27/04/2022

O cérebro é um dos órgãos mais complexos do corpo humano, contudo apresenta uma capacidade limitada de regeneração. No cérebro adulto, as células estaminais neurais quiescentes (qCENs) apenas dão origem a um número limitado de novas células. Contudo após lesão, a maior parte dessas qCENs é ativada, o que suporta a continuidade de proliferação. Compreender os meandros da ativação destas qCENs dependente de lesão poderá moldar o desenvolvimento de novas terapias para lesões cerebrais. O modelo animal Drosophila melanogaster é geneticamente acessível e tem disponível uma ampla variedade de ferramentas para realizar manipulações em células específicas. Além disso, a maioria dos processos é mediada por vias moleculares que estão conservadas em mamíferos. No cérebro adulto da mosca, foi identificado um grupo de progenitores neurais quiescentes, que após lesão podem dar origem a novos neurónios no lobo ótico. Estas características tornam a mosca da fruta um ótimo modelo animal para estudar a ativação das células estaminais e neurogénese no contexto de lesão. Neste projeto, utilizámos um método de rastreamento de linhagem celular dependente de recombinação mitótica, o qual marca a divisão de células progenitoras e a sua descendência em tecidos adultos, com GFP e RFP membranar. Usámos FACS para isolar seletivamente células em proliferação de lobos óticos dissociados e realizámos uma análise de RNAseq para identificar genes e vias de sinalização específicos induzidos por lesão em clusters de regeneração (CRs). Os CRs foram sequenciados em três clusters: 2 dias após lesão (Cluster regenerativo inicial), 6 dias após a lesão (CR intermédio) e 10 dias após a lesão (CR tardio). Focámo-nos nas alterações representadas no CR inicial, o qual é enriquecido em progenitores em divisão, que provavelmente apresentarão assinaturas associadas à ativação de células estaminais neurais em contexto de lesão. A análise bioinformática identificou um total de 161 genes diferencialmente expressos no CR inicial. Além disso, encontramos vias de sinalização específicas e alterações metabólicas que aparecem alteradas neste cluster, incluindo a sobreexpressão da sinalização Wingless-related integration site/Wingless (Wg/Wnt), Notch, Hedgehog (Hh) e Hippo e indução proeminente de transportadores ABC. Em termos de metabolismo, o CR inicial mostra maior uso de glicose por acção da via da pentose fosfato, enquanto a sobreexpressão transcricional de componentes que suportam a fosforilação oxidativa estavam presentes nos clusters mais tardios que estão maioritariamente enriquecidos em neurónios diferenciados. De seguida, fizemos depleção da função de um conjunto de genes altamente regulados no CR inicial em moscas adultas para identificar candidatos que regulem a ativação de proliferação celular após lesão. Com base neste ensaio genético funcional in vivo baseado em RNAi, identificámos 9 genes, cuja depleção alterou significativamente o nível de divisões celulares. Entre esses candidatos, focámo-nos num gene ainda não caracterizado chamado CG14309, que se apresentou altamente induzido após lesão nos resultados do RNAseq, e realizámos mais experiências in vivo. Além disso, a análise de expressão no cérebro adulto após lesão mostrou que este gene, semelhante a uma heparanase, está fortemente expresso em glia e progenitores neurais. A sobreexpressão deste gene em qualquer um desses tipos de células promoveu elevados níveis de proliferação. Além disso, a função do CG14309 foi especificamente necessária em células progenitoras neurais para promover a proliferação induzida por lesão, o que nos indicou que era necessário para a saída do estado de quiescência e consequente ativação dos progenitores. Estabelecemos ainda que o CG14309 pode modular a actividade da via Bone morphogenetic proteins/Decapentaplegic (BMP/Dpp) e que essa função é necessária para manter a quiescência. De facto, a depleção do ligando principal BMP/Dpp desencadeia divisões celulares, no entanto a sua sobreexpressão tem o efeito contrário. Em resumo, identificámos vias e programas metabólicos in silico que estão ativados em clusters regenerativos específicos no cérebro adulto da mosca. Além disso, este trabalho revelou diversos novos marcadores para CENs, ainda pouco explorados na mosca. Por último, os nossos resultados apoiam um papel importante de uma enzima semelhante a uma heparanase, anteriormente não caracterizada, na regulação das CENs em contexto de lesão em Drosophila. The brain is one of the most complex organs of the human body, however it presents limited regenerative capacity. In the adult brain, a strongly limited number of new cells are generated by quiescent neural stem cells (qNSCs). Upon injury, the bulk of qNSCs does not enter an activated state that supports proliferation. Understanding the intricacies of injurydependent qNSCs activation can shape the development of new therapies for brain damage. The animal model Drosophila melanogaster is genetically accessible with an extensive toolbox available to perform cell-type specific manipulations. Moreover, most of the processes are mediated by molecular pathways that are conserved in mammals. In the adult fly brain, a pool of quiescent neural progenitors which can give rise to new neurons in the optic lobes upon tissue damage has been identified. These features, makes the fly a great animal model to study injury-dependent stem cell activation and neurogenesis. Here, we have used a mitotic-dependent genetic lineage tracing system that marks dividing progenitors and their progeny in adult tissues with membrane GFP and RFP. We used FACS to selectively isolate proliferating cells from dissociated optic lobes and performed RNAseq analysis to identify genes and pathways signatures of activated progenitors. Three different clusters were sequenced, an Early Regenerative Cluster (RC) contemplating progenitor cells collected 2 days after injury, an Intermediate RC at 6 days after injury and Late RC at 10 days after injury. Our focus was to identify genes that were specifically regulated in regenerative cells, so the Early RCs was the main focus of our analysis where a total of 161 genes were identified as differentially expressed. Furthermore, specific signalling pathways and metabolic changes were identified. Signalling pathways like Wingless-related integration site/Wingless (Wnt/Wg), Notch, Hedgehog and Hippo or ABC transporters were upregulated in Early RCs. Regarding metabolism, in the Early RCs the main source of energy was the pentose phosphate pathway which by Late RCs shifted to oxidative phosphorylation. We also observed elevated levels of protein synthesis in the Early RCs, a feature already conserved upon activation of stem cells in other tissues or species. An in vivo proliferation screen was performed with the highly induced genes, from which we identify 9 genes whose knockdown significantly altered proliferation. Among them, we focused our work on an uncharacterized gene named CG14309. This heparanase-like gene was strongly induced in glia and neural stem cells after injury. Overexpression of this gene in either of these cell types induced high levels of proliferation. Furthermore, CG14309 was specifically required in glia and neural progenitor cells for injury-induced proliferation which indicated that it was necessary to induce progenitor activation and exit of quiescence. Heparanases in mammals have been associated with Bone morphogenetic protein/Decapentaplegic (BMP/Dpp) signalling. We discovered that the Dpp pathway needs to be downregulated to trigger injuryinduced proliferation. We then sought to find if CG14309 levels could modulate the BMP/Dpp pathway. Overexpressing heparanase-like caused a strong reduction of the BMP/Dpp pathway. In summary, we identified in silico pathways and metabolic programs that could be regulating damage-induced stem cells in the adult fly brain. Furthermore, our findings provided the first evidence of a heparanase-like in the Drosophila animal model whose transcription can impact neural stem cell state, after a traumatic brain injury.

Autores da comunidade :

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  M

  Mariana Batista Santos

  ist427003

Orientadores desta instituição:

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  M

  Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo

  ist24804

101503660

Doutoramento em Bioengenharia

industrial-biotechnology - Biotecnologia Industrial

Palavras-chave

• Adult brain
• Neural stem cells
• Drosophila melanogaster
• CG14309
• BMP/Dpp signalling
• Cérebro adulto
• células estaminais neurais
• via de sinalização BMP/Dpp

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