Lactic acid bacteria as cell factories: a synthetic biology approach for plasmid DNA and recombinant protein production

04/16/2018

O objetivo da presente tese é desenvolver uma plataforma de Bactérias Ácido Lácticas (LAB)/plasmídeos artificiais altamente eficiente para a produção de DNA plasmídico (pDNA) de grau farmacêutico e proteínas recombinantes para aplicações terapêuticas. Vacinas de DNA (ou plasmídeos) são ferramentas promissoras para a prevenção de doenças infeciosas, assim como para o tratamento de doenças adquiridas, tal como o cancro. As atuais plataformas Escherichia coli/plasmídeo levantam preocupações relativamente à sua segurança, devido à possível co-purificação de lipopolissacarídeos, o que aumentaria os custos de purificação, assim como o risco de disseminação de genes de resistência. Várias espécies de LAB têm um estatuto de grau alimentar e são geralmente reconhecidas como seguras (GRAS), tornando-as a escolha ideal quando o objetivo é produzir vacinas de DNA e proteínas recombinantes que poderão ser utilizadas como moléculas terapêuticas para vacinação mucosal usando LAB geneticamente modificadas. A estirpe hospedeira de LAB escolhida para esta tese foi a Lactococcus lactis subsp. lactis LMG19460, pois os L. lactis têm uma elevada relevância industrial e são a estirpe modelo de LAB para uso laboratorial, estando disponíveis várias ferramentas de Biologia Molecular. Além disso, ao contrário doutras bactérias Gram-positivas, apenas secreta para o meio extracelular uma proteína principal (Usp45), simplificando os processos de purificação downstream. Esta espécie é também capaz de sobreviver pelo menos 2-3 dias no trato gastrointestinal humano, sem evocar respostas imunitárias fortes no hospedeiro, tornando-a ideal para ser usada como vetor vivo para vacinação mucosal. Esta estirpe específica é de extrema relevância quando o objetivo é a clonagem de genes ou a transferência de DNA, devido ao facto de ser livre de plasmídeo, não existindo plasmídeos endógenos e/ou contaminantes patogénicos a serem copurificados. O facto de ser livre de plasmídeo também contribui para reduzir a carga metabólica associada à replicação do plasmídeo, permitindo que a célula redirecione os seus esforços para o plasmídeo de interesse, aumentando o rendimento de produção de plasmídeo e proteínas recombinantes associadas. Também é importante referir que o genoma desta estirpe foi sequenciado e publicado no contexto da presente tese. O plasmídeo principal usado nesta tese foi o pTRKH3, um plasmídeo shuttle capaz de replicar em hospedeiros Gramnegativos e Gram-positivos, devido à presença das origens de replicação p15A e pAMβ1, respetivamente, juntamente com os genes de resistência à tetraciclina e eritromicina. Os objetivos principais da presente tese consistem em responder a três grandes desafios: 1) o baixo número de cópias dos plasmídeos disponíveis para LAB; 2) a presença dum elevado nível de atividade de endonucleases na maior parte das estirpes; e 3) a implementação duma plataforma altamente eficiente de LAB/plasmídeo de elevado número de cópias. O primeiro desafio tem dois objetivos específicos, que corresponde ao nível de engenharia do plasmídeo: 1.1) aumentar o número de cópias de plasmídeo (PCN) fazendo mutagénese dirigida à sequência Shine-Dalgarno da origem de replicação; e 1.2) usar Gibson Assembly para construir um plasmídeo mínimo com partes melhoradas, para aumentar o PCN. Um plasmídeo com um elevado número de cópias é um dos principais requisitos para se alcançar uma plataforma industrialmente rentável para a produção de pDNA para vacinas de DNA ou proteínas heterólogas para serem utilizadas como antigénios em vacinação mucosal. Até agora, o maior PCN reportado em bactérias Grampositivas para o replicão pAMβ1 foi de cerca de 100 cópias por célula de Bacillus subtilis. No capítulo 2, o local de ligação ao ribossoma (RBS) do operão repDE do plasmídeo pTRKH3 foi alvo de mutagénese dirigida, dando origem ao mutante de elevado PCN pTRKH3-b, que era capaz de produzir 215 cópias de plasmídeo por cromossoma após 10.5 horas de crescimento, correspondendo a um aumento de 3.5 vezes relativamente ao pTRKH3 não modificado (62 cópias por cromossoma). No capítulo 3, foi utilizada uma abordagem inovadora e versátil para construir um plasmídeo mínimo usando a tecnologia de BioBricks, com o objetivo final de obter um replicão seguro e de elevado número de cópias e, consequentemente, um elevado rendimento de proteínas recombinantes. Cada BioBrick foi introduzido junto a outro ou trocado usando a técnica de Gibson Assembly. Para além duma cassete de replicação em E. coli, as principais partes a introduzir são uma cassete de replicação em LAB que permita um elevado PCN e uma cassete de expressão de proteínas em eucariotas, para a produção de vacinas de DNA. Além disso, está prevista também a introdução duma cassete de expressão de proteínas recombinantes em LAB para vacinação mucosal. A cassete de expressão de proteínas em LAB será testada com uma via sintética de produção de curcumina, atualmente em estudo na presente tese. This thesis aims to develop a highly efficient Lactic Acid Bacteria (LAB)/artificial plasmid platform for the production of pharmaceutical-grade plasmid DNA and recombinant proteins with therapeutic applications. DNA (or plasmid) vaccines are promising tools for the prevention of infectious diseases as well as treatment of acquired diseases such as cancers. The current Escherichia coli/plasmid-based platforms raise safety concerns such as co-purification of lipopolysaccharides, which increases purification costs, and the risk of spreading resistance genes. Several LAB species have a food-grade and Generally Recognized As Safe (GRAS) status, which make them the ideal choice when the goal is to produce DNA vaccines and recombinant proteins that can be used as therapeutic molecules in mucosal vaccination with engineered LAB. The chosen GRAS LAB host strain used in the present thesis was Lactococcus lactis subsp. lactis LMG19460, since L. lactis has a high industrial relevance and is the model LAB laboratory strain, with several molecular tools already available. Also, unlike other Gram-positive bacteria, it only secretes one major protein (Usp45) into the extracellular medium, simplifying the downstream purification processes. They are also able to survive through the gastrointestinal tract of humans for at least 2-3 days without evoking strong host immune responses, making them ideal to be used as live vectors for mucosal vaccination. This specific strain is of utmost relevance for gene cloning and DNA transfer purposes, since it is a plasmid-free strain, having no copurifying endogenous plasmids and/or pathogenic contaminants. The plasmid-free status also contributes to decrease the metabolic burden associated with plasmid replication, allowing the cell to redirect its efforts towards the plasmid of interest, increasing the plasmid and also the associated recombinant proteins yields. It is also important to refer that the genome of this strain was sequenced and published in the context of the present thesis. The backbone plasmid used in this thesis was pTRKH3, a shuttle vector able to replicate both in Gram-negative and Gram-positive hosts, due to the presence of a p15A and pAMβ1 origin of replication, respectively, together with tetracycline and erythromycin resistance genes. The major goals of the present PhD thesis are to answer to three major challenges: 1) the low copy number of the available LAB plasmids; 2) the presence of a high level of endonuclease activity in the majority of the strains; and 3) the implementation of a highly efficient LAB/high copy number plasmid platform. The first challenge has two main specific goals, which correspond to the plasmid engineering level: 1.1) increase the plasmid copy number (PCN) by site-directed mutagenesis of the Shine-Dalgarno sequence of the origin of replication; and 1.2) use Gibson Assembly to engineer a minimal plasmid with improved parts, to increase the PCN. A plasmid with a high PCN is one of the major requirements to achieve an industrially profitable platform for the production of pDNA for DNA vaccines or heterologous proteins to be used as antigens in mucosal vaccination. Until now, the highest number of copies already reported in gram-positive bacteria for the highly stable pAMβ1 replicon was around 100 copies per Bacillus subtilis cell. On chapter 2, the repDE Ribosome Binding Site (RBS) of the pTRKH3 plasmid was engineered by site-directed mutagenesis, generating the high PCN pTRKH3-b mutant, which was able to achieve 215 copies of plasmid per chromosome after 10.5 hours of growth, which corresponds to a 3.5 fold increase when compared to the non-modified pTRKH3 (62 copies per chromosome). On chapter 3, it was used an innovative and versatile approach to assemble a minimal plasmid, using BioBrick technology, with the final purpose of obtaining a safe and high copy replicon and, consequently, high yield of recombinant protein. Each BioBrick can be easily assembled together or exchanged using the Gibson Assembly technique, in order to test different alternatives. Besides an E. coli replication cassette, the main parts to assemble are a LAB replicative cassette that allow a high PCN and also an eukaryotic protein expression cassette, for DNA vaccines production. In addition, a LAB recombinant protein expression cassette for mucosal vaccination is encompassed. The LAB protein expression cassette will be tested with a curcumin synthetic pathway currently under study in the present thesis.

Authors in the community:

• 

  S

  Sofia de Oliveira Dias Duarte

  ist34471

  Affiliations and sources

  IST > iBB

  Instituto de Bioengenharia e Biociências

101610823

Doutoramento em Biotecnologia e Biociências

biological-sciences - Biological sciences

Keywords

• Bactérias ácido lácticas
• DNA plasmídico
• Proteínas recombinantes
• Biologia sintética
• Engenharia de estirpes
• Lactic Acid Bacteria
• Plasmid DNA
• Recombinant proteins
• Synthetic biology
• Strain engineering

eng - English

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