Dissecting the mechanisms of notch signalling in human HSCs: implications in stem cell expansion

Joana Isabel Gonçalves Carmelo

Key information

Authors:

Joana Isabel Gonçalves Carmelo (Joana Isabel Gonçalves Carmelo)

Supervisors:

Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva (Cláudia Lobato da Silva); Fernando dos Anjos Afonso

Published in

07/14/2020

Abstract

O sangue é um dos tecidos mais regenerativos do corpo humano, em que mais de 100 biliões de novas células sanguíneas são produzidas por dia num adulto saudável. Atualmente acredita-se que o sistema hematopoiético é organizado hierarquicamente, em que no topo se encontram as células com maior potencial de auto-renovação e diferenciação, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs), que dão origem a células progenitoras mais comprometidas que se tornam progressivamente mais restritas em termos da sua capacidade de diferenciação, originando finalmente as células sanguíneas maduras. O sistema hematopoiético necessita, portanto, de ser rigorosamente regulado. A via de sinalização Notch foi já associada a decisões de destino celular em hematopoiese, mas o seu papel na regulação de HSCs humanas em condições homeostáticas ainda não é evidente. A via de sinalização Notch também tem sido explorada em protocolos de expansão ex vivo de células hematopoiéticas estaminais e progenitoras (HSPCs) do sangue do cordão umbilical (UCB). Todavia, os mecanismos moleculares desencadeados pela interação com os diferentes ligandos Notch não são ainda compreendidos e são necessários estudos mais abrangentes. Um dos objetivos deste trabalho foi realizar uma comparação lado a lado dos efeitos dos ligandos Notch, Delta-like1 (Dll1), Delta-like4 (Dll4) e Jagged1 (Jag1), quando apresentados a HSPCs in vitro. No estudo realizado foi observado que após cultura de curto-prazo, o Dll4 foi capaz de duplicar o número de células com potencial de repopulação, enquanto que o Jag1 promoveu a manutenção destas células. Mecanisticamente verificou-se que o Jag1 bloqueia a progressão no ciclo celular através da sobre-expressão de p57, ao passo que o Dll4 bloqueia a diferenciação através da sub-expressão de CEBPα. Outro objetivo deste trabalho foi avaliar as funções dos recetores Notch, NOTCH1 (N1) e NOTCH2 (N2) através de silenciamento génico com shRNA por meio de vetores lentivirais em UCB HSPCs. Após uma extensa validação em linhas celulares, as eficiências de silenciamento obtidas em HSPCs foram em média de 72% e 89% para os recetores N1 e N2, respetivamente. Foi verificado que ambos os recetores são fortemente expressos nas populações HSPC e HSC, com maior ativação em HSCs. No estudo de xenotransplante foi observado que, apesar de não ter afetado o enxerto total, o silenciamento dos recetores N1 e N2 em HSPCs transplantadas provoca diferentes efeitos in vivo. o silenciamento do recetor N1 favoreceu significativamente a diferenciação mieloide sobre a linfoide, aumentando também a frequência de progenitores hematopoiéticos, enquanto que o silenciamento do recetor N2 diminuiu significativamente a frequência de HSCs. Neste trabalho foi também desenvolvido um vetor lentiviral com componentes de ponta para silenciamento e sobrexpressão génica induzível. Estes vetores otimizados all-in-one Tet-on com duas cores foram desenvolvidos integrando os melhores componentes disponíveis na literatura e apresentam um desempenho superior aos mesmo tipo de vetores atualmente disponíveis. Com estes vetores foi observado um controlo firme da expressão génica, alta indutibilidade e estabilidade ao longo do tempo, gerando silenciamento ou expressão de proteína robustos, que não se verificam na ausência de indução. The blood is one of the most highly regenerative tissues in the human body, with more than 100 billion new blood cells being produced every day in a healthy adult. It is currently believed that the haematopoietic system is hierarchically organised, where at the top reside the cells with higher self-renewal and differentiation capacity, the haematopoietic stem cells (HSCs), which give rise to more committed progenitors that become progressively more restricted in terms of their differentiation capacity, finally originating the mature blood cells. Thus, the haematopoietic system needs to be tightly regulated and the Notch signalling pathway has been linked to cell fate decisions in haematopoiesis, however its role in the regulation of steady-state human HSCs is still unclear. Notch signalling has also been explored for ex vivo expansion of umbilical cord blood (UCB) haematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), however, there is a lack of understanding of the molecular mechanisms triggered by the different Notch ligands and a need for more comprehensive studies. One of the aims of this work was to perform a side-by-side comparison of the effects of Notch ligands, Delta-like1 (Dll1), Delta-like4 (Dll4) and Jagged1 (Jag1), when presented to HSPCs in vitro. In the study performed it was observed that after a short-time culture, Dll4 was able to duplicate the number of cells with repopulating capacity, whereas Jag1 promoted maintenance of these cells. Mechanistically it was verified that Jag1 blocks cell cycle progression through upregulation of p57 while Dll4 blocks differentiation through downregulation of CEBPα. Another aim of this work was to evaluate the roles of Notch receptors, NOTCH1 (N1) and NOTCH2 (N2) through lentiviral shRNA-mediated gene silencing in UCB HSPCs. After a thorough validation in cell lines, average knockdown efficiencies of 72% and 89% were achieved for N1 and N2 receptors in HSPCs, respectively. Both receptors were found to be highly expressed on HSPC and HSC populations, with higher activation in HSCs. In the xenotransplantation assay it was observed that, although the total human engraftment was not affected, N1 and N2 receptors silencing in the transplanted HSPCs promoted different phenotypic outcomes in vivo. N1 receptor silencing significantly favoured myeloid over lymphoid differentiation, while increasing the frequency of haematopoietic progenitors but had no effect in HSCs, whereas N2 receptor silencing significantly decreased HSCs frequency. In this work it was also developed state-of-art lentiviral vectors for inducible gene silencing and overexpression. These optimised all-in-one Tet-on dual colour vectors were developed by integrating the best features available in the literature, presenting a superior performance to the same type of vectors currently available. With these vectors it was observed a tight inducibility that led to potent knockdowns or protein overexpression which were stable overtime in vitro and virtually silent in the absence of induction.