Tuning extracellular cues to regulate epithelial cell phenotype

Maria João Pardelha da Cruz

Key information

Authors:

Maria João Pardelha da Cruz (Maria João Pardelha da Cruz)

Supervisors:

Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva (Cláudia Lobato da Silva); Molly Morag Stevens

Published in

04/28/2020

Abstract

As células epiteliais formam camadas coesas que revestem todas as superfícies do nosso corpo e actuam principalmente como uma barreira seletiva, a qual permite o transporte de nutrientes e água, enquanto evita a entrada de agentes nocivos externos. Adicionalmente, as células têm a capacidade de detectar e responder a estímulos biofísicos e bioquímicos provenientes do meio extracelular. Nesta tese, é investigada a regulação de aspectos fundamentais do comportamento de células epiteliais mamárias por manipulação de factores bioquímicos e biofísicos do ambiente extracelular. Uma das principais características dos carcinomas invasivos é a infiltração da matriz intersticial por parte de células transformadas que provêm do compartimento epitelial, adquirindo assim o potencial de metastatizar. Neste trabalho, células epiteliais mamárias humanas (MCF10A) são expostas a componentes da membrana basal, que fornecem os elementos necessários para a arquitetura adequada do tecido epitelial, e a concentrações incrementais de colagénio estromal num modelo de morfogénese tridimensional, resultando num fenótipo invasivo induzido pela presença do colagénio na matriz. Uma vez que estas alterações fenotípicas se assemelham a um processo denominado por transição epitélio-mesenquimal (EMT), diversas ferramentas biomoleculares para medição da expressão de genes e proteínas, assim como microscopia e espectroscopia Raman, são utilizadas para caracterizar este programa celular. A desregulação do processo de EMT pode contribuir para o desenvolvimento e progressão de doenças, nomeadamente fibrose e cancro. Neste trabalho, células MCF10A submetidas a EMT, em resposta ao tratamento com transforming growth factor β1 (TGF-β1) ou à presença de colagénio estromal, são expostas a um fragmento biologicamente activo da cadeia β1 da laminina-111 para investigar se o mesmo pode ser usado para modular este processo celular. A exposição destas células epiteliais ao fragmento, utilizando diferentes estratégias, como factor solúvel ou imobilizado em biomateriais, é estudada com base na expressão de genes associados ao processo de EMT e na capacidade de invasão celular. A interação entre este fragmento e potenciais ligandos é também avaliada. O estudo da modulação de EMT utilizando o fragmento de laminina pode fornecer informações importantes sobre o mecanismo molecular desta transição celular no contexto de patogénese e, potencialmente, abrir novas vias de investigação que fazem uso de moléculas bioativas que podem ser libertadas pela matriz extracelular por proteólise. Os campos elétricos endógenos são essenciais aos processos fisiológicos de todos os organismos, nomeadamente no controlo de aspetos fundamentais do comportamento celular, como morfologia, expressão de genes, proliferação e migração. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos que permitem que células detectem e respondam a campos electrics. Neste trabalho, é estudada a resposta biomecânica de células MCF10A expostas a uma estimulação elétrica (ES) externa através de um polímero condutor (polipirrol) biocompatível. Ao combinar sinergisticamente técnicas de microscopia de varrimento por conductância iónica (SICM), microscopia de força atómica (AFM) e ferramentas de biologia molecular, é possível alcançar uma caracterização com resolução temporal e espacial de como células epiteliais mamárias recebem e respondem a sinais de ES. Estes resultados poderão ajudar a compreender de que forma a ES altera o comportamento celular aquando da utilização de sinais elétricos em aplicações biomédicas. Epithelial cells form very cohesive sheets that line all surfaces of our bodies and mainly act as a selective barrier, supporting nutrient and water transport while preventing the entry of external insults. In addition, cells can sense and respond to the biophysical and biochemical cues from the surrounding extracellular milieu. In this thesis, the regulation of important aspects of mammary epithelial cell behaviour by different external stimuli is investigated. A hallmark of invasive carcinomas is the breaching of the basement membrane, in which transformed cells migrate from the epithelial compartment to the interstitial matrix, thereby acquiring the potential to metastasise. In this PhD thesis, human mammary epithelial (MCF10A) cells are exposed to components of the basement membrane, which support epithelial tissue architecture, and to increasing concentrations of stromal collagen in a three-dimensional morphogenesis assay, which lead to a matrix collagen-induced invasive phenotype. Since these phenotypical changes highly resemble a process termed epithelial-mesenchymal transition (EMT), this cellular programme is comprehensively characterised by employing biomolecular tools (gene and protein expression), microscopy and Raman spectroscopy. Dysregulated EMT can contribute to the development and progression of disease, namely fibrosis and cancer. In this work, MCF10A cells undergoing EMT, in response to transforming growth factor β1 treatment or to stromal collagen, are exposed to a biologically-active fragment from the β1-chain of laminin-111 to investigate whether this cryptic extracellular matrix (ECM) fragment can be used to modulate this cellular process. Exposure of these epithelial cells to this fragment via soluble and biomaterial-based approaches is investigated by measuring EMT gene expression and cell invasion. The interaction between this fragment and potential binding partners is also assessed. Studying the modulation of EMT by using an ECM fragment can provide important insight into molecular mechanisms of this cellular transition in the context of pathogenesis, and potentially open new research avenues that make use of bioactive molecules in the ECM that can be released by proteolysis. Endogenous electric fields are essential in the physiological processes of all living organisms, namely in controlling fundamental cellular functions, such as morphology, gene expression, proliferation, and migration. However, little is known about the mechanisms that allow cells to sense and respond to an electric field. In this work, the biomechanical response of MCF10A cells exposed to an external electrical stimulation (ES) via a biocompatible, conducting polymer (polypyrrole) is carried out. By synergistically combining scanning ion conductance microscopy (SICM), atomic force microscopy (AFM) and molecular biology tools, a highly-sensitive characterisation of how mammary epithelial cells sense and respond to ES was carried out. These findings can potentially shed light on how these cells sense and mediate electrical cues, and how ES affect cell fate.