Self-sufficient point-of-care platform for diagnosis of tropical diseases

Débora Cristina Batista de Albuquerque

Key information

Authors:

Débora Cristina Batista de Albuquerque (Débora Cristina Batista de Albuquerque)

Supervisors:

Susana Isabel Pinheiro Cardoso de Freitas (Susana Isabel Pinheiro Cardoso de Freitas); Verónica Cristina Baião Martins Romão (Verónica Cristina Baião Martins Romão); Elisabete Ramos Fernandes

Published in

2025

Abstract

Alterações climáticas e globalização têm impulsionado o aumento da incidência de doenças virais transmitidas por vectores (Zika, dengue e chikungunya), não apenas nos trópicos, como também no ocidente. Juntamente com a recente pandemia de SARS-CoV-19, a necessidade de métodos de diagnóstico e monitorização de doenças que sejam precisos, rápidos e baratos, nunca foi tão clara. Contudo, o diagnóstico actual destas doenças baseia-se em testes moleculares e/ou serológicos, feitos separadamente, requerindo infraestruturas laboratoriais. Neste trabalho é proposta uma abordagem de dupla análise para detecção de doenças virais tropicais negligenciadas, onde ensaios sorológicos e moleculares são combinados numa única análise realizada num sistema portátil magnetorresistivo. Este tipo de ensaio garante uma avaliação precisa da fase de infecção, poupando tempo e custos associados a múltiplos testes independentes. Anticorpos IgG antiZika e anti-dengue foram detectados com sucesso no soro de pacientes infectados, usando uma nova abordagem que combina estratégia competitiva e em sanduíche. Curvas de calibração com faixas dinâmicas entre 10 ng/mL e 1 µg/mL foram estabelecidas, alcançando LODs de 7.86 e 5.72 pM para anti-ZIKV e anti-DENV anticorpos. Valores globais de sensibilidade de 100% e de especificidade de 92% e 71% foram obtidos para DENV e ZIKV. A detecção de RNA até algumas centenas de pM foi também conseguida para os três vírus, após o desenho de sondas oligo e primers para amplificação por RT-PCR. O aumento da portabilidade do ensaio foi alcançada usando equipamento minituriarizado para amplificação do RNA. Ensaios duplos foram realizados, onde RNA viral e anticorpos foram detectados simultaneamente, em canais de reação separados. Os resultados obtidos na detecção dos alvos moleculares e sorológicos na abordagem de dupla análise não apresentam diferença significativa entre os obtidos individualmente, comprovando a viabilidade e precisão do ensaio de detecção dupla. Este formato de ensaio representa um novo paradigma no diagnóstico de infecções virais. Climate change and globalization have been drivers for increased incidence of tropical vector-borne viral diseases (e.g., Zika, dengue and chikungunya), not only in the tropics, but also in western territory. Coupled to the recent SARS-CoV-19 pandemic, the need for accurate, fast, and inexpensive disease diagnosis and monitorization methods is clearer than ever. Current diagnostics for these diseases tend to focus either on molecular or serological testing and require laboratory infrastructures. In this work a dual detection assay approach for neglected tropical viral diseases is proposed, where both serological and molecular assays are combined in a single analysis performed on a portable magnetoresistive system. This type of assay guarantees an accurate assessment of the infection phase, saving time and costs associated with multiple independent tests. Human IgG anti-Zika and antidengue antibodies were successfully detected in infected patients’ serum, using a novel approach combining competitive and sandwich strategies. Calibration curves with dynamic ranges between 10 ng/mL and 1 μg/mL were established achieving LODs of 7.86 and 5.72 pM for anti-ZIKV and anti- DENV antibodies, respectively. Overall sensitivity values of 100 % and specificity values of 92% and 71% were obtained for DENV and ZIKV. Viral RNA detection down to a few hundreds of pM was also successfully carried out after the design of specific oligo probes and primers for RT-PCR amplification. Increased assay portability was achieved by using microPCR equipment. Dual assays were performed for both viruses, where viral RNA and anti-virus antibodies were simultaneously detected, in separate reaction channels. The results obtained for the detection of the molecular and serological targets in the dual assay format show no significant difference between the ones obtained individually, proving the feasibility and accuracy of the dual detection assay. This assay format represents a new paradigm in viral infections diagnostics.