Extracellular vesicles manufacturing across mammalian platforms: dendrimer-driven upstream innovation and scalable downstream solutions

Ricardo Miguel Medalha da Silva

Key information

Authors:

Ricardo Miguel Medalha da Silva (Ricardo Miguel Medalha da Silva)

Supervisors:

Vasco Daniel Bigas Bonifácio (Vasco Daniel Bigas Bonifácio); Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo (Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo); Sandra Cristina Nunes Trigo Fernandes Pinto (Sandra Cristina Nunes Trigo Fernandes Pinto)

Published in

January 14, 2026

Abstract

As vesículas extracelulares (VEs) são vesículas derivadas de células, secretadas para o espaço extracelular, que têm vindo a atrair cada vez mais atenção devido ao seu potencial como agentes terapêuticos e sistemas de administração de fármacos com elevada eficiência e especificidade. À medida que a área avança, o foco tem vindo a mudar para como podem as VEs serem implementadas na clínica. Todavia, existem desafios significativos associados à sua bio manufatura. Na produção (upstream) a produtividade associada às células é baixa, enquanto na purificação (downstream) as estratégias aplicadas são pouco desenvolvidas e incapazes de suprimir as quantidades e necessárias de produto devidamente puro para o uso clínico. Estes fatores dificultam a translação clínica e o acesso ao produto. Este trabalho propõe-se a abordar os desafios associados à bio manufatura de VEs. A adição do dendrímero PUROG4 a Células Renais Embrionárias Humanas 293T aumentou a libertação de VEs em 1,8 vezes. Para acelerar a implementação clínica, foram desenhadas duas estratégias de isolamento escaláveis e eficazes: a cromatografia de troca aniónica, que explora a carga negativa das VEs, e a cromatografia de exclusão estérica, que as separa por tamanho. A primeira demonstrou ser capaz de fornecer um produto com a elevada pureza exigida pelas agências reguladoras. Por fim, os resultados podem ser integrados numa plataforma de manufatura digital no utilizando o software SuperPro Designer®. Esta ferramenta permite estudar diferentes cenários, considerando desafios tecnológicos e aspetos económicos. Para finalizar, este trabalho contribui para o desenvolvimento de uma plataforma de produção de VEs sustentável e de custo-eficaz, aproximando estas terapias dos doentes. Extracellular vesicles (EVs) comprise a broad range of cell-derived phospholipid bilayer membrane vesicles that are secreted into the extracellular space. In recent years, EVs have emerged as a major focus of research, with growing evidence supporting their potential use as therapeutic agents and in next-generation drug delivery systems. As the field matures, focus has shifted from exploring the potential of EVs in clinical therapy to addressing how they can be effectively implemented. However, significant challenges remain throughout the entire biomanufacturing chain – from upstream to downstream. In the upstream, mammalian cell productivity is characterised by low secretion yields, while the downstream strategies remain poorly developed, being unable to supply clinic in sufficient quantities of highly pure product. Together, these challenges hamper clinical translation and limit product accessibility. Ergo, the present work proposes to address these manufacturing challenges. To do so, PUROG4 dendrimer was added to HEK 293T cells as an EVs secretion stimuli, increasing the number of released EVs in 1.8-fold. To accelerate clinical implementation EVs isolation strategies were designed. The first, explores the negative charge found on EVs surface by anion exchange chromatography (AEX), while the second takes advantage of EVs size to separate them from impurities by steric exclusion chromatography (SXC). Both strategies are scalable, effective and, in the case of AEX, capable of delivering highly purified product meeting the requirements imposed by regulatory agencies. At the end, our group results and literature findings could be integrated and an EVs manufacturing platform using SuperPro Designer® software. This dynamic tool facilitates the study of different scenarios, while considering technological challenges, but also economical aspects. In the end, the results obtained in this work could help to contribute to the development of a sustainable and cost-effective EVs manufacturing platform, bringing EVs-based therapies closer to patients.