Unveiling the complex regulatory network governing antifungal drug resistance in Candida glabrata: from new regulators to new effectors

Pedro Henrique Magalhães Fernandes Pais

Informações chave

Autores:

Pedro Henrique Magalhães Fernandes Pais (Pedro Henrique Magalhães Fernandes Pais)

Orientadores:

Miguel Nobre Parreira Cacho Teixeira (Miguel Nobre Parreira Cacho Teixeira)

Publicado em

27/09/2019

Resumo

A aquisição de resistência a drogas tem sido associada ao insucesso da terapia antifúngica, especialmente em infeções causadas por Candida glabrata. Por esta razão, é crucial perceber as bases moleculares deste fenómeno, de forma a guiar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais adequadas. Com este objetivo, o trabalho descrito nesta tese tem o intuito de contribuir para o conhecimento do papel de redes de regulação transcricional na resistência a antifúngicos em Candida glabrata. A base de dados PathoYeastract (www.pathoyeastract.org) foi desenvolvida, incluindo um conjunto de ferramentas para analisar e prever associações regulatórias nas quatro espécies de Candida mais prevalentes. Toda a informação publicada relativa a associações regulatórias de Fatores de Transcrição (FT) e motivos de ligação ao DNA foi recolhida e incorporada na base de dados. Foram desenvolvidas ferramentas para a análise integrada de respostas transcricionais ao nível de genes ou genomas completos, permitindo a previsão de redes regulatórias e comparações inter-espécies baseadas em associações ortólogas descritas noutras espécies de leveduras. O papel de três fatores de transcrição na mediação da resistência a antifúngicos foi estudado. Embora a função do FT CgPdr1 na resistência a fluconazol esteja bem estudada, o mesmo não é o caso para outros antifúngicos, especialmente o efeito do FT CgPdr1 ao nível da expressão proteica. Com base na identificação do FT CgPdr1 como sendo um determinante de resistência a imidazóis e 5-flucitosina, o efeito da sua expressão na resposta ao nível de proteínas de membrana em resposta a clotrimazol e 5- flucitosina foi estudado, usando para tal proteómica baseada em iTRAQ-MS. Verificouse que a concentração de 37 ou 32 proteínas de membrana encontra-se alterada durante tratamento com clotrimazol ou 5-flucitosina, respetivamente, e que o FT CgPdr1 controla cerca de 50% dessas alterações. Com base nestes resultados, verificou-se que os antiportadores droga:H+ CgTpo1_1 e CgTpo1_2 conferem resistência a clotrimazol, enquanto que os antiportadores droga:H+ CgFlr1 e CgFlr2 conferem resistência a 5- flucitosina; em ambos os casos actuam por diminuição da acumulação intracelular de antifúngico. A remodelação da parede celular também ocorre em resposta a ambos os antifúngicos, sendo que no caso do clotrimazol o mesmo se deve, pelo menos, à presença da proteína de parede CgGas1. A ocorrência de mutações de ganho de função no FT CgPdr1, levando à sua ativação, é frequentemente a causa da expressão constitutiva de bombas de efluxo, resultando na resistência a antifúngicos da família dos azóis. No entanto, vários estudos referem a descoberta de isolados de C. glabrata resistentes a azóis que não possuem mutações de ganho de função no FT CgPdr1, o que sugere a existência de mecanismos adicionais de resistência a azóis que são desconhecidos nesta levedura. Como resultado de uma triagem para encontrar novos FTs que possam estar envolvidos em resistência a antifúngicos, os FTs CgRpn4 e CgMar1 foram identificados como determinantes de resistência a fluconazol em C. glabrata. A sua função neste fenómeno foi avaliada através da técnica de sequenciação de RNA, tendo sido associada ao controlo do metabolismo de lípidos da membrana plasmática. O FT CgRpn4 regula a ativação de genes de síntese de ergosterol, incluindo ativação direta do gene CgERG11, que constitui o alvo dos azóis. O FT CgMar1 regula metabolismo de esfingolípidos, nomeadamente a ativação do translocador de esfingolípidos CgRsb1 e a incorporação de esfingosina na membrana plasmática. Os resultados obtidos mostram que os FTs CgRpn4 e CgMar1, respetivamente, participam no controlo dos níveis de ergosterol e esfingolípidos durante tratamento com fluconazol, contribuindo assim para diminuir a permeabilidade de membrana e consequentemente a acumulação do antifúngico em células de C. glabrata. De modo geral, esta tese contribui para o aumento do conhecimento quanto à regulação transcricional em C. glabrata e como a mesma está organizada, através do desenvolvimento de ferramentas computacionais de análise e apresentando duas novas redes de regulação que contribuem para resistência a azóis em C. glabrata. The acquisition of drug resistance has been implicated in the failure of antifungal therapy, especially against infections caused by Candida glabrata. It is thus crucial to understand the molecular basis of this phenomenon, in order to guide the design of more suitable therapeutic strategies. With this overall goal in mind, the work described in this thesis aims to contribute to extend knowledge on the role of transcription regulatory networks in antifungal resistance in C. glabrata. The PathoYeastract database (www.pathoyeastract.org) was built, comprising a series of tools to predict and analyze transcription regulatory associations in the four major Candida pathogenic species. All published data on Transcription Factor (TF) regulatory associations, and DNA binding motifs was curated and stored in the database. Moreover, tools for the comprehensive analysis on gene or genome-wide transcriptional responses were developed, which further enable the prediction of regulatory networks and cross-species comparison based on orthologous associations described for other yeast species. Additionally, the role of three transcription factors in antifungal resistance was evaluated. Although the role of the TF CgPdr1 in fluconazole resistance had been well established, that is not the case for other antifungals, especially the effect of CgPdr1 at the protein expression levels. Based on the identification of CgPdr1 as a determinant of resistance to imidazoles and 5-flucytosine, the effect of CgPdr1 expression on membrane protein levels in response to clotrimazole and 5-flucytosine was studied, using iTRAQ-MS-based proteomics. The concentration of 37 or 32 membrane proteins was found to change upon clotrimazole or 5-flucytosine stress, respectively, CgPdr1 controlling about 50% of those changes. Based on the obtained results, the Drug:H+ Antiporters CgTpo1_1 and CgTpo1_2 were found to mediate clotrimazole resistance, while CgFlr1 and CgFlr2 were found to contribute to 5-flucytosine resistance, in both cases by decreasing intracellular drug accumulation. Cell wall remodeling was also found to occur in response to both drugs, in the case of clotrimazole through the specific participation of the CgGas1 cell wall protein. It is frequently the occurrence of Gain-of-Function (GOF) mutations in CgPdr1, leading to its activation, that results in constitutive expression of drug efflux pumps and, consequently, azole drug resistance. However, several studies reported the identification of C. glabrata clinical isolates that display azole resistance, but no CgPdr1 GOF mutations, suggesting the existence of additional unknown mechanisms of antifungal resistance in this yeast. As a result of a screening for new TFs that might be involved in antifungal drug resistance, the TFs CgRpn4 and CgMar1 were found as additional determinants of fluconazole resistance in C. glabrata. Their role in this phenomenon, assessed through RNA-sequencing, was found to include, at least, the control of plasma membrane lipid metabolism. CgRpn4 was found to be required for the activation of ergosterol biosynthesis genes, including direct activation of the azole target CgERG11. CgMar1 was found to regulate sphingolipid metabolism, particularly the activation of the sphingolipid flippase CgRsb1 and the incorporation of sphingosine in the plasma membrane. Obtained results support the notion that CgRpn4 and CgMar1 participate in the control of ergosterol and sphingolipid levels during fluconazole stress, respectively, contributing to decrease plasma membrane permeability and the consequent fluconazole accumulation in C. glabrata cells. Altogether, this thesis extends our understanding of how transcription regulation is orchestrated in Candida species by providing a new computational tool for its analysis, while presenting two novel regulatory networks that contribute to azole resistance in C. glabrata.