Genetic modulation of pediatric cerebral vasculopathy in sickle cell anemia

Sandra Marisa Duarte da Silva

Informações chave

Autores:

Sandra Marisa Duarte da Silva (Sandra Marisa Duarte da Silva)

Orientadores:

Maria Paula Duarte Faustino Gonçalves, Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho (Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho)

Publicado em

18/06/2021

Resumo

A drepanocitose é uma patologia genética resultante da homozigotia para a mutação HBB:c.20A>T, a qual origina a hemoglobina S. Esta, em condições de hipoxia, polimeriza no interior dos eritrócitos conferindo-lhes uma morfologia falciforme, aumento da rigidez e fragilidade. Consequentemente, desencadeiam-se mecanismos fisiopatológicos complexos, incluindo inflamação, adesão celular, stresse oxidativo e vaso-oclusão. A doença é fenotipicamente heterogénea devido à ação moduladora de fatores ambientais e genéticos. Uma das manifestações com maior impacto é a vasculopatia cerebral pediátrica, nomeadamente o AVC isquémico e o enfarte cerebral silencioso. Neste trabalho pretendeu-se identificar o potencial modulador de variantes em genes relacionados, por exemplo, com a adesão de células sanguíneas ao endotélio (VCAM1, ITGA4) ou com o tónus vascular (NOS3), no risco e ocorrência da referida vasculopatia cerebral. Efetuámos estudos de associação genótipo/fenótipo em 70 crianças com drepanocitose, previamente caracterizadas em termos fenotípicos. Seguidamente, realizámos análises in silico para as variantes genéticas potencialmente moduladoras dos fenótipos e, por fim, estudos funcionais com modelos de células endoteliais de origem macrovascular e microvascular cerebral. Verificámos que existe uma associação positiva entre a presença de variantes no promotor de VCAM1 (haplotipo 7 e rs1409419_T), assim como em ITGA4 (rs113276800_A e rs3770138_T), e a ocorrência de AVC. As análises in silico indicaram a potencial alteração de locais de ligação de fatores transcricionais devido à presença da rs1409419_T. Por outro lado, os estudos funcionais permitiram concluir que a presença dos haplotipos 4 e 7 no promotor de VCAM1, associados respetivamente a hemólise grave e AVC pediátrico, levam a um aumento da atividade deste promotor em células endoteliais micro e macrovasculares estimuladas com TNF-. Verificámos, ainda, in vitro, que o principal fármaco usado para o tratamento da doença, a hidroxiureia, diminui a expressão de VCAM1 induzida por TNF-. Globalmente, os nossos resultados reforçam o potencial modulador de VCAM1 no risco de vasculopatia, cerebral e sistémica, em drepanocitose. A elevada frequência dos haplotipos estudados em crianças de origem subsariana pode afetar a forma como estas reagem às estratégias atuais de prevenção e tratamento do AVC. Os nossos resultados poderão, assim, auxiliar na conceção de planos terapêuticos alternativos para doentes que não respondam ao tratamento com hidroxiureia. Sickle cell anemia (SCA) is a genetic disease caused by homozygosity for the HBB:c.20A>T mutation, which results in the production of hemoglobin S (HbS). In hypoxic conditions, HbS polymerizes inside the erythrocytes, altering their morphology into a sickle shape, with increased rigidity and fragility. This triggers complex pathophysiological mechanisms, including inflammation, cell adhesion, oxidative stress, and vaso-occlusion. SCA is phenotypically heterogeneous due to modulation of both environmental and genetic factors. Pediatric cerebral vasculopathy, namely ischemic stroke and silent cerebral infarctions, is one of the most impactful manifestations. Herein we aimed to identify the modulator effect on the risk and occurrence of pediatric cerebral vasculopathy in SCA, of variants in genes involved, for example, in blood cell endothelium adhesion (VCAM1, ITGA4) or vascular tone (NOS3). We started with candidate gene association studies in a group of 70 SCA children, with previous phenotypical characterization. Subsequently, we analyzed in silico the genetic variants with phenotype modulation potential. Finally, we performed functional studies using macrovascular and microvascular endothelial cell models. We found a positive association between stroke occurrence and the presence of genetic variants in the VCAM1 promotor (haplotype 7 and rs1409419_T), as well as in ITGA4 (rs113276800_A and rs3770138_T). In silico analyses indicated a potential change in transcription factor binding sites due to the presence of the rs1409419_T variant. On the other hand, functional studies showed that the presence of VCAM1 promoter haplotypes 4 and 7 – associated with severe hemolysis and pediatric stroke, respectively – increased VCAM1 promoter activity in TNF--stimulated macrovascular and microvascular endothelial cells. Furthermore, we observed that in vitro treatment with hydroxyurea – the most frequently used drug for ischemic stroke management and prevention in SCA children – decreased TNF--induced VCAM1 expression. Overall our results reinforce the VCAM1 modulation potential on systemic, as well as cerebral, vasculopathy risk in SCA. Being frequent in children of Sub-Saharan ancestry the studied haplotypes may affect how they react to current stroke prevention and treatment strategies. Ultimately, the knowledge we obtained may help devise management strategies for patients non-responsive to hydroxyurea treatment.