Síntese de peptidoglicano bacteriano reconhecido pelo sistema imunitário

Luísa da Conceição Costa Rainho de Carvalho

Informações chave

Autores:

Luísa da Conceição Costa Rainho de Carvalho (Luísa da Conceição Costa Rainho de Carvalho)

Orientadores:

Maria Manuel Marques (Maria Manuel Marques); Maria Matilde Soares Duarte Marques (Maria Matilde Soares Duarte Marques)

Publicado em

28/11/2008

Resumo

The innate immune system constitutes the first line of defense against microorganisms in both vertebrate and invertebrates. It is still an open question how the recently identified host receptors recognize microbial ligands and their role in host defense. Peptidoglycans (PGN) from Gram-positive and negative bacteria are microbial ligands that seem to be recognized by different pattern recognition receptors such as Toll-like receptors or peptidoglycan recognition proteins (PGRPs). Cellular activation by pattern recognition receptors results in acute inflammatory responses and recent studies revealed that the PGN minimal structure required to activate the Drosophila Toll pathway is a dimeric muropeptide isolated from the bacterial cell wall. A major problem associated with these studies, and that constitutes an obstacle for further research development in this area, is the need of ligand purification from whole bacterial cell walls – contaminations have led in the past to contradictory conclusions. Structure-activity relationship (SAR) studies will allow the elucidation of the molecular recognition process and establish the structural features responsible for the interacting peptidoglycan component with the corresponding PGRP. Thus, in this project a PGN monomer was synthesized, for further SAR studies. The peptide chain synthesis was assembled by solid-phase synthesis (SPS) using 9- fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc SPS) group, as amine protecting group, due to its mild conditions, and carbohydrate unit preparation was performed using an orthogonal protecting group strategy. Subsquently the synthesized disacharide was coupled with the previously prepared peptide, still bounded to the resin, (D-Ala-D-Ala-L-Lys-(Ddiv)-D-Gln-L-Ala-NH2), and after removal of the lysine side chain protecting group Ddiv, five units of glycine were introduced. The last step of the synthesis consisted of protecting group’s removal as well as cleavage of the muropeptide from the resin. The obtained muropeptide was purified by HPLC and characterized by spectroscopic techniques, and the final yield was 3%. Moreover, HR MAS NMR of the sinthetized molecules anchored to the resin studies were also performed. O sistema imunitário inato constitui a primeira linha de defesa contra microorganismos em vertebrados e em invertebrados, permanecendo em aberto a forma pela qual os receptores do hospedeiro reconhecem os ligandos microbianos assim como o seu papel na defesa. As unidades de peptidoglicano (PGN’s) quer de bactérias Gram-positivas quer de bactérias Gram-negativas, são um dos constituintes microbianos que parecem ser reconhecidos por diferentes padrões de receptores, tais como os receptores Toll, ou por proteínas de reconhecimento celular (PGRP’s). A activação celular devido a estes receptores resulta numa resposta inflamatória aguda, e estudos recentes revelam que a estrutura mínima de PGN requerida para activar o mecanismo Toll da Drosophila é constituída por um dímero de muropéptidos isolado a partir da parede celular bacteriana. No entanto, a maior dificuldade associada a estes estudos, constituindo um obstáculo ao desenvolvimento da investigação nesta área, é a difícil purificação desta estrutura a partir da parede celular bacteriana, já que em estudos anteriores, a presença de contaminações levou a conclusões contraditórias. A realização de estudos da relação estrutura-actividade (SAR) permitirá elucidar o processo de reconhecimento molecular, assim como indentificar a estrutura responsável pela interacção entre o PGN e a correspondente PGRP. Nesta dissertação foi realizada a síntese de um monómero de PGN, para posterior utilização em estudos SAR. Desta forma, a cadeia peptídica do monómero de PGN foi preparada através de uma estratégia de síntese em fase sólida (SPS) recorrendo ao grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc SPS) como grupo protector do grupo amina, devido às condições suaves deste método, e a unidade glicosídica sintetizada através de uma estratégia de protecção ortogonal de açúcares. Posteriormente, o dissacárido sintetizado foi acoplado à cadeia peptídica previamente preparada, e ainda ancorada à resina, (D-Ala-D-Ala-L-Lys-(Ddiv)-D-Gln-L-Ala-NH2), e após remoção do grupo protector da cadeia lateral da lisina efectuou-se a ramificação da cadeia peptídica tendo-se introduzido cinco unidades de glicina. Os últimos passos consistiram na remoção de grupos protectores bem como na remoção do muropétido da resina. O muropéptido foi purificado por HPLC e a sua estrutura confirmada por técnicas espectroscópicas, tendo-se obtido o muropéptido com 3% de rendimento. Neste trabalho foram ainda desenvolvidos diversos estudos de HR MAS NMR dos compostos sintetizados ancorados à resina.