Miniaturized platform to capture bioproduct

Malik Abdul Wahab

Informações chave

Autores:

Orientadores:

Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros (Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros); Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo (Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo)

Publicado em

18/07/2023

Resumo

Com o foco crescente na produção de biofármacos, existe a necessidade de desenvolver novos processos de biofabricação com boa relação custo-benefício e o foco tem sido o desenvolvimento de processos contínuos, pois levam a um alto rendimento e reduzem os custos. Além disso, é necessário considerar a abordagem holística em vez de considerar uma etapa de cada vez. Os dispositivos microfluídicos com vantagens em termos demenor consumo de reagentes e baixo tempo de residência, têm estado na vanguarda do desenvolvimento de processos, pois permitem implementar tanto a abordagem contínua quanto a integrada. O objetivo deste trabalho foi o projeto, fabricação e utilização de uma plataforma microfluídica integrada para produção e posterior purificação de biomoléculas, que permite a integração do processo a montante de produção com os processos a jusante de purificação Foram considerados três módulos: um micro-quimiostato para produzir proteína continuamente; um módulo de lise para liberação e recuperação de proteínas intracelulares e um módulo de purificação para concentrar e purificar a proteína de interesse usando extração líquido-líquido. O micro-quimiostato é constituído por duas camadas: a camada fluídica com os canais que constituem o bioreator e a camada de controlo com as válvulas e a bomba peristáltica. O microbiorreator funciona tanto no modo descontínuo como no modo contínuo. E. coli foi cultivada em modo descontínuo e contínuo. No modo contínuo, o foco de maior interesse neste trabalho, verificou-se que um caudal de 0,5 L/min produziu a maior concentração de células em estado estacionário. Além disso, foi desenhado um dispositivo para a lise química contínua e extração de proteína GFP Neste dispositivo as células começam por ser lisadas e de seguida entram no módulo de extração aquosa de duas fases usado para purificação da proteína extraída. O objetivo desta parte do trabalho foi otimizar as condições que podem ser utilizadas posteriormente no sistema totalmente integrado. Os três módulos desenvolvidos foram depois integrados num único dispositivo e as condições otimizadas foram usadas para produzir a proteína GFP usando E. coli como hospedeiro no micro-quimiostato. Após a cultura de E. coli durante 24h, as células foram lisadas e por fim o sistema de extração aquosa de duas fases PEG-fosfato foi usado para concentrar a GFP na fase rica em PEG demonstrando uma abordagem integrada que pode ser usada para a avaliação de todo o processo de uma só vez e entender o efeito em cascata dos vários módulos. With increasing focus on the production of biopharmaceuticals there is need for developing novel cost-effective biomanufacturing processes and the focus have been on developing continuous process as they lead to high yield and reduce cost. Moreover, there is need to consider the holistic approach rather than considering one step at a time. Microfluidics with its advantages like low reagent consumption and low residence time have been at the forefront of process development as it accommodates both continuous and integrated approach. The goal of this work has been on the design, fabrication and operation of an integrated microfluidic platform, using GFP produced by E. coli as model system, for production and subsequent purification of biomolecules, allowing integration of upstream with downstream process. Three modules are considered; a microbioreactor to produce protein continuously; a lysis module for intracellular proteins release and recovery and a purification module to concentrate and purify the protein of interest using liquid-liquid extraction. The microbioreactor consisted of two layered devices with a fluid layer as bioreactor channel and a control layer with valves and integrated peristaltic pump. Microbioreactor has the ability to work both in semi continuous and continuous mode. In case of continuous mode, which is of greater interest here, it was found that optimum flowrate of 0.5L/min provided the highest cell concentration at steady state. An integrated chip was designed for continuous chemical lysis and extraction using aqueous two-phase extraction to process cell samples for lysis and subsequent purification of GFP. The goal of this part of work was to optimize conditions that can be subsequently used for fully integrated system. The three-unit operations were than integrated on a single chip and optimum conditions were used to produce GFP using E. coli as host in a microbioreactor. After the production of cells were first lysed and then PEG-phosphate ATPS was used to concentrate and purify GFP in the PEG rich phase, demonstrating an integrated approach that can be used for evaluation of the whole process at once and understand the cascading effect of multiple modules.