Portable magnetic flow cytometer for the detection of hospital bacterial infections

March 7, 2022

The rising incidence of infectious diseases, increased food and water safety concerns, and the new government initiatives and funding to detect and control antimicrobial-resistant species are demanding breakthrough advancements in bioanalytical tools for pathogen detection. Moreover, the clinical prevalence of Pseudomonas aeruginosa, and Klebsiella pneumoniae pathogens underscores the importance of rapid detection approaches to contain nosocomial infections and reduce the development of drug resistance. Current microbiological detection systems often lack precision, affordability, and portability. Furthermore, they require long detection times, sophisticated infrastructures, and trained personnel, which prevent their applicability at resource-limited settings. In this thesis work, some of these challenges were addressed by developing a magnetic flow cytometer technology. Flow cytometers have become essential instruments in biomedical research and routine clinical tests for disease diagnosis, prognosis, and treatment monitoring. Magnetic flow cytometers ally the potential for cell detection and counting to the advantages of a lab-on-a-chip technology, pushing forward the progress in integrated and compact systems for on-site testing. In particular, magnetoresistive sensors (MR) and magnetic labelling processes were exploited, promoting high capture efficiencies of magnetically labelled targets and generating strong magnetic fields. The MR chip was integrated with a microfluidic system with a small heigh dimension to improve the system sensitivity by promoting the labeled targets to be closer to the sensing units. Chip design optimizations regarding the maximization of the sensor sensitivity and reduction of electromagnetic interferences, as well as improving the processing signal analysis and boosting multiplex capabilities were performed. Protocols for the functionalization of bacteriophages and antibodies onto the surfaces of the magnetic nanoparticles were optimized and validated for the magnetic labelling of bacterial cells (K. pneumoniae and P. aeruginosa) spiked in buffer solution, as well as, directly from clinical rectal swabs. The results showed capture efficiencies over 70 % with specificity. The whole system was integrated with an electronic acquisition setup for the sensors addressing and read-out in collaboration with INESC ID. A signal classification method based on simulations was proposed to distinguish signatures of clustered magnetic particles from magnetically labelled targets. Also ,the method has the ability to aid in the identification of the number of magnetically labelled bacteria associated with each detected event. This platform was tested and validated for the detection of Klebsiella pneumonia in laboratory samples as well as a pilot study was conducted with clinical rectal swab samples collected from 45 patients admitted to the emergency department of Hospital Beatriz Ângelo (Loures, Portugal). Overall, this work mostly outlies relevant aspects concerning biosensor development, demonstrating how magnetic flow cytometry can be explored as an accurate, sensitive, and portable device that can be applied for bacteria detection and identification. O aumento da incidência de doenças infecciosas, o aumento das preocupações com a segurança alimentar e as novas iniciativas e financiamento do governo para detectar e controlar espécies resistentes a antimicrobianos estão a promover o desenvolvimento de novas ferramentas bioanalíticas para detecção de bactérias patogénicas. Além disso, a prevalência clínica das bactérias Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae ressalta a importância de abordagens de detecção rápida para conter infecções nosocomiais e reduzir o desenvolvimento de resistência aos medicamentos. Os atuais sistemas de detecção microbiológica muitas vezes carecem de precisão, acessibilidade e portabilidade. Além disso, eles exigem longos tempos de detecção, infraestruturas sofisticadas e pessoal especializado, o que impede a sua aplicabilidade em ambientes com recursos limitados. Neste trabalho, alguns desses desafios (rapidez e miniaturização) foram abordados através do desenvolvimento de uma tecnologia de citometria de fluxo magnética. Os citómetros de fluxo tornaram-se instrumentos essenciais em estudos científicos na área biomédica, assim como nos testes clínicos de rotina para o diagnóstico, prognóstico e monitorização do tratamento de doenças. Os citómetros de fluxo magnético aliam o potencial para detecção e contagem de células às vantagens de uma tecnologia ‘lab-on-a-chip’, impulsionando o progresso de sistemas integrados e compactos para testes no local. Em particular, sensores magnetorresistivos (MR) e processos de marcação magnética foram explorados, promovendo uma alta eficiência de captura de alvos magneticamente marcados e gerando fortes campos magnéticos sobre as unidades de detecção magnéticas. O chip MR foi integrado com um sistema microfluídico para uma manipulação eficiente da amostra para as áreas de detecção, e com pequena dimensão de altura para promover a que os alvos magneticamente marcados passem mais próximos das unidades de detecção, aumentando a sensibilidade do método. Protocolos de funcionalização de bacteriófagos e anticorpos na superfície de nanopartículas magnéticas foram otimizados e validados para a marcação magnética de células bacterianas (K. pneumoniae e P. aeruginosa) em amostras preparadas em laboratório, bem como, em amostras clínicas de zaragatoas retais. Os resultados obtidos revelaram capturas de 70% com especificidade. Todo o sistema foi integrado a uma plataforma de aquisição eletrónica para endereçamento e leitura dos sensores, em colaboração com o INESC ID. Um método de classificação de sinais baseado em simulações foi proposto para auxiliar na identificação do número de bactérias magneticamente marcadas associadas a cada evento de detecção, bem como na capacidade de distinguir assinaturas de partículas magnéticas livres ou aglomerados de partículas. Esta plataforma foi validada para a detecção de Klebsiella pneumoniae em amostras laboratoriais, bem como foi realizado um estudo piloto com amostras clínicas de zaragatoas retais recolhidas de 45 doentes internados no serviço de urgência do Hospital Beatriz Ângelo (Loures, Portugal). No geral, este trabalho destaca aspectos relevantes sobre o desenvolvimento de bio sensores, demonstrando como a citometria de fluxo magnética pode ser explorada como um dispositivo preciso, sensível e portátil que pode ser aplicado para detecção e identificação de bactérias.

Authors in the community:

• 

  A

  Ana Rita Sintra Soares

  ist188113

Supervisors of this institution:

• 

  S

  Susana Isabel Pinheiro Cardoso de Freitas

  ist14366

• 

  V

  Verónica Cristina Baião Martins Romão

  ist45930

• 

  J

  João Manuel Braz Gonçalves

  ist419131

101522207

Doutoramento em Engenharia Física Tecnológica

physical-sciences - Physical sciences

Keywords

• Citometria de fluxo magnético
• Sensores magnetorresistivos
• Bactérias associados a infecções hospitalares
• Partículas magnéticas
• Testes no local
• Magnetic flow cytometry
• Magnetoresistive sensors
• Healthcare-associated pathogens
• Magnetic particles
• On-site testing

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