The anticancer potential of the bacterial protein azurin and its derived peptides: mode of action and development of a nanosized drug delivery system for lung cancer therapy

Ana Rita Cebola Garizo

Informações chave

Autores:

Ana Rita Cebola Garizo (Ana Rita Cebola Garizo)

Orientadores:

Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho (Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho); Bruno Filipe Carmelino Cardoso Sarmento

Publicado em

24/09/2021

Resumo

A azurina é uma proteína bacteriana com propriedades anticancerígenas. Esta característica singular resulta de um conjunto único de características estruturais, que incluem uma estrutura geral em sanduíche β semelhante às imunoglobulinas com um domínio hidrofóbico e uma grande hélice α anfipática, ambas localizadas na superfície desta proteína. Um péptido bioativo derivado da azurina (denominado p28) que abrange a hélice α, tem propriedades de penetração celular e exerce atividade anticancerígena por reconhecimento seletivo de células cancerígenas. Este péptido foi avaliado em dois ensaios clínicos de fase I em humanos. Inicialmente, neste trabalho, o resíduo de fenilalanina114 localizado no centro do domínio hidrofóbico exposto da azurina foi substituído por um resíduo de alanina. Com esta substituição de um único aminoácido, foi demonstrado, dependente da dose, que esta região da proteína é importante para a sua entrada preferencial nas células cancerígenas. Além disto, verificou-se que o reconhecimento inicial de células cancerígenas parece ser mediado, pelo menos em parte, pela caveolina-1 (Cav-1) e pelo gangliosídeo-1 (GM-1), componentes pertencentes a microdomínios de jangadas lipídicas dispostos nas membranas plasmáticas. Após tratamento com a azurina nativa, foi observada uma diminuição da ordem membranar, ao contrário do tratamento com a proteína mutada. Em segundo lugar, foi estudado o potencial anticancerígeno de um péptido (CT-p19LC) derivado do C-terminal da azurina. Os dados indicaram que este péptido exibe propriedades ativas de membrana e induz a morte de células cancerígenas. Por fim, o p28 foi pela primeira vez associado a um nanosistema de entrega de fármacos para terapia direcionada ao cancro de pulmão. A funcionalização de nanopartículas (NPs) com este péptido, permitiu aumentar a sua internalização em células cancerígenas A549, bem como foi capaz de diminuir a viabilidade destas células, sem qualquer efeito em células não cancerígenas 16HBE14o- . In vivo, os estudos com xeno-enxerto subcutâneo de A549 mostraram que NPs funcionalizadas com p28 e carregadas com gefitinib (GEF), um inibidor da atividade tirosina quinase do recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), frequentemente superexpresso em células de cancro de pulmão, reduziram a carga tumoral primária de A549 e a formação de metástases pulmonares. Assim, foi possível concluir que a seletividade intrínseca do p28 manteve-se mesmo este estando ligado a NPs, sendo esta característica utilizada como uma mais valia neste tipo de aplicações, enquanto que o GEF foi entregue às células-alvo. Com base no trabalho desta tese, considerou-se a azurina, uma fonte de péptidos bioativos anticancerígenos capazes de serem associados a estratégias de entrega de fármacos para o desenvolvimento de terapias mais eficazes, e possíveis de serem aplicadas a qualquer tipo de cancro. Azurin, a protein from bacterial origin, has been found to exhibit anticancer properties. This singular characteristic results from a unique set of structural features, which include an overall immunoglobulin-like β-sandwich scaffold with a hydrophobic patch and a large amphipathic -helix, both located on the surface of the protein. A bioactive azurin derived peptide (termed p28) encompassing the -helix has cell penetrating properties and exerts anticancer activity by selective recognition of cancer cells. The p28 peptide is being evaluated in two phase I human clinical trials. Initially, in this work, the phenylalanine114 residue located on the center of the exposed hydrophobic patch of azurin was replaced with an alanine residue. With this single amino acid substitution, it was shown that this region of the protein is important for its preferential entry into cancer cells in a dosedependent manner. In addition, it was found that the initial recognition of cancer cells appears to be mediated, at least in part, by caveolin-1 (Cav-1) and ganglioside-1 (GM-1), components belonging to lipid rafts microdomains arranged in plasma membranes. After treatment with wild-type azurin, a decrease in membrane order was observed, unlike treatment with the mutated protein. Secondly, the anticancer potential of a peptide (CTp19LC) derived from the C-terminal of azurin has been studied. Data indicated that this peptide exhibits membrane-active properties and induces cancer cell death. Lastly, p28 was associated for the first time with a drug delivery nanosystem for targeted lung cancer therapy. The functionalization of nanoparticles (NPs) with this peptide increased its internalization in A549 cancer cells, as well as was able to decrease the viability of these cells, without any effect in 16HBE14o- non-cancer cells. In vivo, the studies using A549 subcutaneous xenograft showed that p28-functionalized NPs loaded with gefitinib (GEF), an inhibitor of tyrosine kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR), often overexpressed in lung cancer cells, reduced A549 primary tumor burden and lung metastases formation. Thus, it was possible to conclude that the intrinsic selectivity of p28 was maintained even though it was linked to NPs, being this characteristic used as an asset in this type of applications, while GEF was delivered to target cells. Based on the work of this thesis, azurin was considered a source of bioactive anticancer peptides capable of being associated with drug delivery strategies for the development of more effective therapies, and possible to be applied to any type of cancer.