Towards Cost-Effective mRNA-based Therapeutics Manufacturing Processes

Sara Alexandra Peça de Sousa Rosa

Informações chave

Autores:

Sara Alexandra Peça de Sousa Rosa (Sara Alexandra Peça de Sousa Rosa)

Orientadores:

Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo (Ana Margarida Nunes da Mata Pires de Azevedo); Duarte Miguel de França Teixeira dos Prazeres (Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres); Marco Paulo Cardoso Marques (Marco Paulo Cardoso Marques)

Publicado em

12/03/2025

Resumo

mRNA é uma tecnologia emergente no campo das vacinas. Devido à sua precisão e segurança, bem como ao seu método de fabrico flexível, esta tecnologia é atrativa para múltiplas aplicações, desde tratamentos profiláticos e de cancro, até doenças genéticas e metabólicas. Uma caracteristica única destas vacinas é o seu método de fabrico ser simples e flexível: mRNA é produzido numa reação livre-de-células, onde o molde de DNA é transcrito em mRNA (IVT), numa reação catalisada por a RNA polimerase. Um método baseado em inteligência artificial foi utilizado para a optimização da reação de IVT, obtendo-se uma produção de RNA de 12 gmRNA.L-1 em apenas duas horas reacionais. Uma plataforma de manufactura bem estabelecida requer um controlo apertado à presença de dsRNA durante o processo. Nós abordamos este desafio explorando o impacto da sequência de DNA na formação de dsRNA durante a IVT. A optimização das regiões não codificantes levou a uma diminuição de 30% na produção de dsRNA. Uma nova estratégia de monitorização, onde a RNase T1 foi combinada com RP-HPLC, foi desenvolvida. Ista permite quantificar a dsRNA durante o processo sem interferência das impurezas. O processo de manufactura foi também optimizado ao explorar cromatografia de afinidade para capturar diretamente mRNA das reações de IVT. O modelo de IA foi usado para aumentar 7,5 vezes a capacidade da resina. Explorou-se cromatografia multimodal para separar mRNA do dsRNA num processo de um passo, o que potencialmente pode reduzir o custo geral de manufactura. Usando este método, antigiu-se uma recuperação de 81±5% de mRNA, com uma pureza de 88±2% e sem detectar a presença de DNA. Os resultados obtidos contribuem para o estado-da-arte da manufactura de vacinas de mRNA e vai contribuir para o desenvolvimento de um processo sustentável, flexível e económico. mRNA is an emerging technology in the vaccine field. Owing to its precision and safety, as well as flexible manufacture, this technology is attractive for multiple applications, from prophylactic and cancer treatments to metabolic and genetic diseases. One of the most unique characteristics of these vaccines is the simple and flexible manufacturing process: mRNA is produced in cell-free reaction, where DNA template is transcribed into mRNA catalysed by an RNA polymerase (IVT). The highly defined nature of this cell-free reaction makes the process ideal for optimisation. Using a Bayesian optimization method to automate the experiment design, we were able to optimise mRNA production of the IVT reaction to achieve 12 g mRNA.L-1 of reaction in just 2 hours. During IVT reaction, by-products, namely truncated mRNA and dsRNA are co-produced. A wellestablish manufacturing platform requires a thigh control on the presence dsRNA throughout the process. We tackle this by exploring the impact the DNA sequence in dsRNA formation during IVT. Optimising the non-coding regions has led to a decrease of 30% in the production of dsRNA. Additionally, new monitoring strategy was developed were RNase T1 was combined with RP-HPLC. This has allowed to quantify dsRNA throughout the manufacturing process without interference of other impurities. The manufacturing process was further optimised by exploring affinity chromatography to directly capture mRNA from IVT reactions. Using an AI approach, a 7.5-fold increase in the resin binding capacity was obtained. Additionally, multimodal chromatography was explored to separate mRNA from dsRNA in a one-step process, which potentially can reduce the overall manufacturing costs. Using this method, a overall recovery yield of 81±5% was achieved, with a purity of 88±2% and no detectable concentration of DNA. In the end, the results obtained contribute to state-of-art of mRNA vaccines manufacturing and will contribute to the development of sustainable, flexible and cost-effective manufacturing process.