Biomanufacturing platform development for the large-scale production of non-parenchymal cells towards the bioengineering of a porcine whole liver

Sara Morini

Key information

Authors:

Sara Morini (Sara Morini)

Supervisors:

Pedro Miguel Almeida de Matos Baptista; Ana Margarida Pires Fernandes (Ana Margarida Pires Fernandes Platzgummer)

Published in

09/24/2021

Abstract

O transplante de fígado representa a única opção para doentes com doença hepática em estágio terminal (DHET). Lamentavelmente, esta solução é limitada pela procura crescente e pelo fornecimento insuficiente de órgãos disponíveis para transplantação. A bioengenharia de órgãos é baseada no uso de estruturas tridimensionais com uma arquitetura pré-existente para imitar o microambiente complexo dos órgãos, a qual permite a inoculação e a sobrevivência de células funcionais. A descelularização abrange as técnicas usadas para remover o conteúdo celular dos órgãos, preservando a sua estrutura tridimensional composta por matriz extracelular e um sistema vascular acelular intacto. Uma vez descelularizadas, estas estruturas tridimensionais podem ser recelularizadas de forma a criar órgãos funcionais aptos para serem transplantados primeiramente em animais recipientes e, a longo prazo, em pacientes com DHET. Um dos objetivos mais desafiantes do processo de recelularização é reestabelecer uma vasculatura funcional num fígado de tamanho clínico relevante. Para cumprir esse objetivo, é necessária uma grande quantidade de células de diferentes tipos. Desta forma, o objetivo principal deste trabalho é o desenvolvimento de uma plataforma robusta, reprodutível e económica para a produção em larga escala de células não parenquimatosas, nomeadamente células estromais mesenquimatosas derivadas de medula óssea (MSC), células do músculo liso da aorta (SMC), e células endoteliais derivadas da veia umbilical (EC) sob condições de cultura dinâmica. Os três tipos de células foram isolados de leitões de 5 quilos, expandidas sob condições estáticas e caracterizadas. Subsequentemente, foram cultivadas sobre microcarriers em spinner flasks para investigar o efeito de diferentes parâmetros, como o tipo de microcarrier, o meio de cultura e o regime de alimentação. Em geral, usando as melhores condições estudadas para cada tipo de célula, as células alcançaram os números máximos de 17.9 x 106 MSC cultivadas em meio suplementado com lisado plaquetario humano (hPL), 19.8 x 106 SMC cultivadas em meio suplementado com hPL, e 15.2 x 106 EC cultivadas em meio de crescimento endotelial porcino, que correspondem a valores dos fatores de expansão (fold increase) no número de células totais de 7.2, 11.1 e 12.3, respetivamente. De salientar que as células expandidas sob condições de agitação mantiveram o fenótipo em termos de expressão de um conjunto de marcadores específicos, avaliados através de citometria de fluxo e análise de imunofluorescência. Finalmente, conseguimos expandir com sucesso MSC e SMC sob condições completamente controladas em biorreactores de tanque agitado. As células alcançaram os números máximos de 150 x 106 MSC e 185 x 106 SMC cultivadas em meio suplementado com hPL, que corresponde a valores de fatores de expansão de 12.2 e 42, respetivamente. Tal como para as culturas em spinner flask, as células expandidas em biorreactores de tanque agitado mantiveram o seu fenótipo, como confirmado por citometria de fluxo e análise de imunofluorescência. Assim sendo, a expansão em larga escala de células não parenquimatosas porcinas para aplicações de bioengenharia é agora possível usando os métodos desenvolvidos nesta tese doutoral. Liver transplantation represents the only option for patients with end stage liver disease (ESLD). Regrettably, this solution is limited by growing demand and insufficient supply of organs available for transplantation. Organ bioengineering is based upon the use of scaffolds with a preexisting architectural structure to mimic the complex microenvironment of the organs, which allows the seeding and survival of functional cells. Decellularization encompasses the techniques used to remove the cellular content of organs, preserving a scaffold composed of an intact extracellular matrix and vascular tree. Once decellularized, these scaffolds could be recellularized to create functional bioengineered organs able to be transplanted into recipient animals and, in the long-term, into patients with ESLD. One of the most challenging aims of the recellularization process is the re-establishment of a functional vasculature in a liver of a clinically relevant size. To fulfill this goal, we are developing a robust, reproducible, and cost-effective platform for the large-scale expansion of non-parenchymal cell types, namely bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs), aortic smooth muscle cells (SMCs), and umbilical vein-derived endothelial cells (ECs) under dynamic culture conditions. Cells were isolated from 5 kgs piglets, expanded under static conditions and characterized. Afterwards, the three non-parenchymal cells were cultured on microcarriers in spinner flasks to investigate the effect of different parameters such as microcarrier type, culture medium and the feeding regime. Overall, using the best condition studied for each cell type, cells reached maximum numbers of 17.9 x 106 of MSCs cultured using human Platelet Lysate (hPL)-supplemented medium, 19.8 x 106 of SMCs cultured with hPL-supplemented medium, and 15.2 x 106 of ECs expanded with porcine endothelial growth medium, which corresponds to fold increase values in total cell number of 7.2, 11.1 and 12.3, respectively. Importantly, cells expanded under stirred conditions retained their phenotype in what concerns to the expression of a set of specific markers, as assessed by flow cytometry and immunofluorescence analysis. Finally, we were able to successfully expand MSCs and SMCs under fully controlled conditions in stirred tank bioreactors. Cells reached maximum numbers of 150 x 106 of MSCs, and 185 x 106 of SMCs using hPL-supplemented medium, which corresponds to fold increase values in total cell number of 12.2 and 42, respectively. Similarly to spinner flask cultures, cells expanded in stirred tank bioreactors retained their phenotypical identity, as confirmed by flow cytometry and immunofluorescence analysis. Hence, the large-scale expansion of porcine non-parenchymal cells for bioengineering applications is now possible and successful using the methods developed in this doctoral thesis.