Probing the effect of ultraviolet light on biomolecules using a whey milk protein: alpha-lactalbumin

16/12/2008

Prolonged ultraviolet illumination of Ca2+ depleted form of bovine alpha-lactalbumin (bLA) results both in progressive red-shift and increase of tryptophan fluorescence emission. Such spectral changes are related to progressive cleavage of disulphide bonds in illuminated protein molecules, verified by detection of free thiol groups with Elmann?s reagent. The absence of disulphide bridges as fluorescence quenchers and dislocation of tryptophan residues to solvent accessible zones explain the emission changes. After prolonged ultraviolet-irradiation and disulphide bond cleavage, the protein is only partly denaturated, in a native-like conformation. Photolysis of the disulphide bonds is credited to involvement of tryptophan excited species in first order reactions, slowly interconverting into high quantum yield red-shifted species. The presence of a hidden isosbestic point in successive tryptophan emission spectra suggests such equilibrium. It was proven that one of the major reaction pathways is the thermal photoionization of tryptophan excited singlet states with Arrhenius activation energy of 20.5 kJ.mol-1. Light induced immobilization of Ca2+ depleted bLA form was attempted using 50.37 nm gold nanoparticles (AuNP).The technique is based on the affinity to gold surfaces of free protein thiol groups formed upon ultraviolet-irradiation. AuNP provenient of reaction with irradiated bLA show no net difference in hydrodynamic radius compared to fresh AuNP after Dynamic Light Scattering measurements. However, Energy Dispersive X-ray spectroscopy shows unusual nitrogen contents on this reaction product. Such observations indicate that bLA might immobilize onto AuNP forming a thin film on the gold surface. The complexes nanoparticle-bLA may be of biomedical interest, as molecular carriers or biosensors. A iluminação constante com luz ultravioleta de α-lactalbumina de bovino desprovida de Ca2+ resulta em dois efeitos progressivos na emissão dos triptófanos da proteína: aumento da intensidade e red-shift. As mudanças espectrais sentidas estão relacionadas com quebra paralela de pontes dissulfureto na proteína iluminada, verificada pela detecção de grupos tiol livres com o reagente de Elmann. As diferenças acima referidas são explicadas pela ausência destas pontes como agentes inibidores de fluorescência e exposição dos triptófanos ao solvente. Após iluminação prolongada observou-se que a proteína se encontrava apenas parcialmente desnaturada, numa conformação similar à nativa. A fotólise destas pontes é atribuída ao envolvimento de espécies excitadas dos triptófanos em reacções de primeira ordem, com interconversão lenta para produtos caracterizados por red-shift e elevada intensidade de fluorescência. Ficou provado que um dos principais mecanismos envolve a fotoionização térmica de singletos excitados de triptófanos, com uma energia de activação de 20.5 kJ.mol-1 . A proteína foi igualmente submetida a imobilização em nanoparticulas de ouro (AuNP) de 50.37 nm. A técnica baseia-se na afinidade de superfícies de ouro para os grupos tiol da proteína formados após irradiação com luz ultravioleta. As AuNP provenientes da reacção com proteína iluminada não mostram diferenças consideráveis em diâmetro após medição de Dynamic Light Scattering. Contudo, o espectro obtido por Energy Dispersive X-ray spectroscopy indica a presença de nitrogénio nas AuNP. Estas observações dão indícios de imobilização por formação de filme fino na superfície das AuNP. Estes complexos nanoparticula-proteína poderão ter um tremendo interesse biomédico, como transportadores moleculares ou biosensores.

Autores da comunidade :

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  M

  Manuel Guilherme Laranjeira Pedrosa Martins Correia

  ist151804

Orientadores desta instituição:

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  M

  Maria Teresa Neves-Petersen

  ist407496

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  D

  Duarte Miguel De França Teixeira dos Prazeres

  ist13392

Mestrado em Engenharia Biológica

industrial-biotechnology - Biotecnologia Industrial

Palavras-chave

• α-lactalbumina
• Pontes dissulfureto
• Inibição de fluorescência
• Reacção fotoquímica
• Imobilização assistida por luz ultravioleta
• Nanoparticulas de ouro

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Instituto Superior Técnico