A platform to assess the role of physiological culture conditions in mesenchymal stem cell immunomodulation

Carolina Gaspar Tomás Cunha Rodrigues

Key information

Authors:

Carolina Gaspar Tomás Cunha Rodrigues (Carolina Gaspar Tomás Cunha Rodrigues)

Supervisors:

Cláudia Alexandra Martins Lobato da Silva (Cláudia Lobato da Silva); Cornelia Kasper

Published in

November 17, 2023

Abstract

Este projeto foca-se em compreender de que maneira as condições de cultura, nomeadamente, cultura 3D, afetam as capacidades imunomoduladoras das células estaminais mesenquimais (MSCs). Esta capacidade funciona por meio de interações intercelulares e da secreção de Vesículas Extracelulares (EVs). Deste modo, o objetivo deste trabalho é o de desenvolver uma plataforma experimental fiável para explorar a relação entre as condições de cultura e o secretoma das MSCs. O projeto dividiu-se em duas fases. Na primeira, desenvolveu-se um processo de funcionalização de hidrogéis 3D usando Colagénio e Ácido Hialurónico metacrilados. Os hidrogéis de Ácido Hialurónico metacrilado (HAMA) mostraram propriedades mecânicas consistentes e conduziram a alta viabilidade celular das células neles encapsuladas. Por outro lado, os hidrogéis de Colagénio metacrilado (CMA) apresentaram inconsistências na reticulação e baixa resistência mecânica. Na segunda fase, criou-se um sistema de ensaio de potência 2D usando citometria de fluxo para avaliar o efeito das MSCs e EVs na proliferação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Foram estabelecidos com sucesso protocolos de coloração e proliferação de PBMCs, bem como o isolamento e caracterização de EVs. O efeito da concentração de oxigénio e a presença de antibióticos no secretoma das MSCs foram testados, observando-se que as condições em hipóxia aumentaram as capacidades imunomoduladoras das MSCs no ensaio baseado em MSC. No entanto, o ensaio baseado em EVs resultou em elevada morte celular, possivelmente devido à dupla coloração das PBMCs. Uma direção futura poderá envolver a fusão das duas fases para criar um ensaio de potência 3D. This project focuses on understanding how the immunomodulatory characteristics of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) can be influenced by their culture environment, specifically in a 3D setting, which better mimics the in vivo conditions. MSCs exhibit their immunomodulatory effects through interactions with other cells and the secretion of Extracellular Vesicles (EVs). This research aims to contribute to bridge the gap in the current knowledge by creating a reliable experimental platform to explore the relationship between culture conditions and MSCs' secretome. The project was divided into two main phases. In the first, a 3D hydrogel functionalization process was developed. Collagen and hyaluronic acid were methacrylated and crosslinked to create hydrogels. While methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogels demonstrated consistent mechanical properties and encapsulated cells were alive 24 hours past encapsulation, methacrylated collagen (CMA) hydrogels showed inconsistent degrees of crosslinking and reduced mechanical strength. The second phase established a 2D potency assay system. Flow cytometry analysis was used to assess how MSCs and EVs affect the proliferation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs). Protocols for staining, proliferation, EV isolation, and characterization were successfully established. The effects of oxygen levels and presence of antibiotics on MSCs' secretome were tested, with hypoxic conditions enhancing their immunomodulatory abilities in the MSC-based assay. However, the 2D EV-based assay faced reliability challenges due to significant cell death, possibly related to PBMCs restaining. The future direction involves merging both phases to create a 3D potency assay, shedding light on how 3D culture conditions impact MSCs' immunomodulatory abilities and secretome.