Development of an integrated microfluidic platform for biomolecule production and purification

Ricardo Gil Fradique

Informações chave

Autores:

Ricardo Gil Fradique (Ricardo Gil Fradique)

Orientadores:

Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros (Maria Raquel Murias dos Santos Aires Barros); João Pedro Estrela Rodrigues Conde (João Pedro Estrela Rodrigues Conde)

Publicado em

02/03/2020

Resumo

Desde que a primeira proteína humana recombinante foi produzida, o crescente uso de micro organismos para a produção de moléculas terapêuticas tem aumentado a necessidade de novos métodos de produção e purificação, mais práticos e económicos. Com o recente foco em aborda gens holisticas, capazes de considerar os efeitos de cada passo do processo na sua performance geral, a microfluidica tem surgido como um método eficaz no teste de uma ampla gama de condições, num espaço de tempo curto, e com baixo consumo de reagentes. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de uma plataforma microfluidica para a produção e purificação de biomoléculas, isto é, dispositivos que integrem múltiplas operações unitárias, que avaliem os efeitos em cascata na performance final. Este trabalho descreve o desenvolvimento e caracterização de três módulos microfluidicos: um microbioreactor, um dispositivo para lise celular, e um dispositivo combinado de lise celular e con centração de proteínas. O microbioreactor integra um aquecedor resistivo para manutenção da temperatura, avaliação continua de densidade optica usando um sensor optico, e controlo de fluidos usando válvulas e bom bas microfluidicas. O dispositivo atingiu fluxos de cerca de 55 µl min−1 , mantendo uma temperatura entre 37 ◦C to 40 ◦C, e nele uma cultura de E.coli susteve uma taxa de crescimento especifico próxima da encontrada em culturas de balão. Um dispositivo baseado em difusão foi também desenvolvido para a triagem rápida de condições de lise química, utilizando a libertação de GFP recombinante produzida em E.coli como sistema modelo. Este foi utilizado para testar a eficiência de várias soluções de lise química e enzimática, com eficiências de cerca de 60% e 100%, respetivamente. De notar a deteção de possíveis problemas durante esta fase, tal como o aumento de viscosidade em determinadas condições, que pode afetar a performance do sistema. Este sistema foi então combinado, num novo dispositivo, com um método de extração por duas fases aquosas, utilizando um sistema de PEG/Fosfato. Este sistema foi primeiro testado para se paração, com coeficientes de partição próximos de 4, e então utilizado para a triagem continua de múltiplas combinações de condições, demonstrando condições em que melhorias na eficiência de lise podem prejudicar a separação, demarcando a necessidade de avaliação dos processos no seu todo. Ever since the development of the first recombinant human therapeutic protein, the increasing use of microorganisms to produce important therapeutic molecules has led to the need for new, practi cal and economical manufacturing and processing methods. With the recent focus on holistic ap proaches, that consider the effects of each process in the overall performance, microfluidics have emerged as a cost-effective method to test a large set of conditions in a short time and with very low reagent consumption. The objective of this work was the development of a microfluidic platform for biomolecule pro duction and purification, that is, a device that integrates multiple unit operations, accounting for the cascading effects on the overall process performance. This work describes the development and characterization of three microfluidic modules: a micro bioreactor, a cell lysis chip, and a combined cell lysis/protein concentration device. The microbioreactor integrated a resistive heater for temperature regulation, optical density mea surements using an optical sensor, and fluid control by integrated microfluidic valves and persistaltic pump. The device operated at about 55 µl min−1 , maintaining a stable temperature in the 37 ◦C to 40 ◦C range, and an E.coli cell culture was able to maintain a specific growth rate close to the one found in flask scale cultures. In addition, a diffusion-based microfluidic device for the rapid screening of continuous chemical lysis conditions was also developed, using the release of a recombinant GFP expressed in E. coli as model system. This was used to test the lytic effect of both enzymatic and chemical lysis solutions, with lysis efficiencies of about 60% and 100%, respectively. Also of note is the detection of potential process issues, such as the increased viscosity that can arise for specific lysis conditions and hinder the performance of a bioprocess. This work was then integrated with an aqueous two phase extraction method in a different device, using a PEG/Phosphate system. This was screened for the separation stage, presenting partition co efficients of about 4, and then used for the continuous screening of multiple condition combinations, highlighting conditions where improvements on the lysis efficiency subsequently impaired the sepa ration, decreasing the partition of the target product, and demonstrating the need for the evaluation of a process in its entirety.