Development of human pluripotent stem cell-derived cardiovascular microtissues for cardiotoxicity screening

Mariana da Mota Veiga de Araújo Branco

Informações chave

Autores:

Mariana da Mota Veiga de Araújo Branco (Mariana da Mota Veiga de Araújo Branco)

Orientadores:

Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo (Maria Margarida Fonseca Rodrigues Diogo), Perpétua Pinto-do-Ó

Publicado em

19/03/2021

Resumo

As células estaminais pluripotentes humanas representam uma fonte única de diferentes tipos de células com enorme potencial para aplicação in vitro e in vivo. Em particular, estas células, bem como os vários tipos de células derivadas, têm sido usadas em diversos estudos relacionados com o desenvolvimento embrionário humano, com a modulação de doenças, com o teste de novos fármacos, e em medicina regenerativa. Especificamente na área cardíaca, os avanços têm sido consideráveis, não só no que diz respeito ao desenvolvimento de protocolos que permitem gerar as diferentes células que compõe o coração humano adulto, como também no desenvolvimento de modelos cardíacos mais complexos e que tentam recapitular a estrutura e função observada no coração humano. Com estes modelos já se mostrou ser possível recapitular e estudar diferentes doenças cardíacas, bem como a possível utilização destes modelos durante a fase pré-clínica para avaliar a cardio-toxicidade de novas drogas. O principal objectivo desta tese é contribuir para o desenvolvimento de um modelo cardíaco multicelular e tri-dimensional (3D) que seja mais fisiológico e que mimetize de forma o mais fiel possível o microambiente do coração humano, em termos funcionais e estruturais, para que possa vir a ser utilizado in vitro nas aplicações previamente mencionadas. Para alcançar este objectivo, começámos por desenvolver uma plataforma 3D para a diferenciação de cardiomiócitos (CMs) a partir de células pluripotentes humanas. Através da utilização de uma plataforma que permite fazer agregação forçada e utilizando um protocolo simples baseado na modulação da via de sinalização Wnt, foi possível gerar agregados de CMs ao fim de 15 dias de diferenciação. Através da optimização da concentração da molécula usada no primeiro passo da diferenciação para activar a via Wnt, e do tamanho dos agregados de células pluripotentes no início da diferenciação, foi possível desenvolver uma plataforma robusta que permite gerar agregados de CMs com uma eficiência igual ou superior a 85% (≥85% células cTNT+ ). Com o objectivo de estudar o impacto associado à realização da em CMs em 3D, comparativamente com o sistema de diferenciação em monocamada (2D), realizou-se uma análise de transcriptómica usando pontos sucessivos ao longo da diferenciação para ambas as condições. Esta análise permitiu concluir que o processo de diferenciação em 3D induz uma predisposição das células pluripotentes a diferenciarem na linhagem de mesendoderme, o que culmina na progressão mais rápida do processo de diferenciação em 3D comparativamente com o que se observa em 2D, traduzindo-se no desenvolvimento de CM mais maduros no final do processo de diferenciação. Progredindo para o desenvolvimento de um modelo 3D cardíaco mais complexo, decidiu-se explorar as células do pro-epicárdio (CPE), tendo em conta a sua importância no desenvolvimento, maturação e função do coração. O primeiro passo foi desenvolver uma plataforma 3D para obter estas células a partir de células pluripotentes humanas. Adaptando o protocolo previamente estabelecido para diferenciar CM em 3D foi possível chegar a uma plataforma que permite gerar ao IV fim de 11 dias de diferenciação CPE com uma eficiência de aproximadamente 80% (±80% de células WT1+ ). Em adição ao desenvolvimento da plataforma, foram também obtidas novas informações sobre as principais vias de sinalização envolvidas na especificação destas células a partir de progenitores de mesoderme. Através de uma análise mais pormenorizada da composição dos agregados de CPE, foi possível detectar a presença de estruturas epiteliais, que foram identificadas como células de intestino (±16% CDX2+ ). Esta observação permitiu-nos perceber que na plataforma base que estabelecemos para o desenvolvimento de diferenciação cardíaca em 3D, é gerada uma população de progenitores composta não só por células da mesoderme como também por células da endoderme, a partir das quais são geradas as células de intestino presentes nos agregados de CPE. Com o objectivo de tentar eliminar esta população de células de intestino, diferentes estratégias foram delineadas, concluindo-se que através de pequenas mudanças na manipulação da via Wnt nos primeiros dias da diferenciação cardíaca, é possível eliminar os progenitores de endoderme e, eventualmente, permitir minimizar o aparecimento de células do intestino nos agregados de CPE. Depois de estabelecida a plataforma para gerar as CPE, o próximo passo foi o desenvolvimento de uma modelo de co-cultura entre estas células e os CMs. Através da optimização de diferentes paramentos, como o momento da diferenciação de ambas as células que é mais apropriado para proceder à junção, o rácio em que ambas as células devem ser combinadas, bem como se seria ou não necessário activar exogenamente alguma via de sinalização para promover a integração e interacção entre os dois tipos celulares, foi possível desenvolver um modelo 3D cardíaca que obedece à definição de organóide. Em particular, gerou-se um modelo cardíaco que se organiza de forma autónoma numa estrutura complexa que (1) apresenta uma camada contínua de células do epicárdio que cobrem um núcleo de CM, (2) apresenta um núcleo de CMs onde é possível distinguir duas zonas diferentes, uma camada mais exterior e em contacto directo com as células do epicárdio, que é mais compacta e os CMs apresentam-se mais alinhados e com actividade proliferativa; e uma camada mais interna onde os CMs apresentação uma menor organização e encontram-se menos compactos, (3) apresenta uma maior expressão da “gap junction” CX43, que é extremamente importante na comunicação entre CMs e no estabelecimento de um tecido coeso e funcional, em toda a zona do núcleo de CM, mas com expressão mais evidente junto à camada externa de células do epicárdio, (4) apresenta uma maior quantidade de deposição de proteínas de matriz,, não só no nucelo de CMs, como também à volta do organóide, o que é indicativo de uma maior presença de fibroblastos, (5) apresenta uma rede de vascularização mais densa, e (6) apresenta indícios de uma maior maturação funcional, revelada através da resposta a diferentes fármacos, tudo estes pontos em comparação com agregados composto apenas por CM e com o mesmo tempo de cultura. Apesar de ainda ser preciso analisar de forma mais robusta o impacto que este novo modelo 3D cardíaco tem ao nível de maturação estrutural e funcional dos CMs, estes resultados preliminares apontam para o desenvolvimento de um modelo mais realístico, que permite recapitular alguns princípios estruturais e funcionais observados nos estadios de desenvolvimento embrionário do coração humano. Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a unique source of any type of human cells and for that reason hPSC-derivatives have been highly explored in different in vitro applications, such as in disease modelling and drug screening settings, but also in regenerative medicine applications. Particularly in the cardiac field, considerable improvements have been made not only regarding the in vitro generation of the different cells that compose the human heart, but also in developing advanced cardiac models, which have been already proved to be a promising tool to study cardiac disorders in vitro and to be used in pre-clinical settings to assess the cardiotoxicity of new developed drugs. The main objective of this thesis is to contribute to this effort with the development of an improved and physiologically more relevant multicellular tri-dimensional (3D) cardiac model that better mimics the in vivo microenvironment of the human heart than previous models. To attain this purpose, it was first developed a 3D cardiomyocyte (CM) differentiation platform that was further used as the starting point to establish a more complex cardiac model. We took advantage of a forced aggregation platform and the modulation of the Wnt signaling pathway to generate hPSC-CMs aggregates. Through a factorial design approach, it was possible to find the optimal concentration of the small molecule used for Wnt signaling activation during the first step of CM differentiation and hPSC-aggregate size at the beginning of differentiation, culminating in a robust and highly efficient (>85% cTNT+ cells) 3D CM differentiation platform. Importantly, throughout the differentiation process, a side-by-side transcriptomic analysis was performed between the 3D cardiac differentiation platform and a parallel and equivalent 2D CM differentiation system. This analysis revealed that the 3D environment promotes a faster progression of the CM differentiation process, resulting in the generation of CMs with an improved maturation. Moving on to the development of a more complex cardiac model, it was decided to explore the use of proepicardial cells (PECs), which have a crucial role during embryonic heart development and whose role is still poorly explored in the literature. Firstly, we developed for the first time a 3D PEC differentiation protocol from hPSCs by adapting the previously established 3D CM differentiation model, which generates ±80% WT1+ hPSC-PECs after 11 days of differentiation. In addition, we have also contributed with novel insights on the main signaling cues that are involved in the generation of those cells in vitro from mesoderm progenitor cells. Moreover, it was found that our 3D protocol of hPSC commitment into cardiac mesoderm, generates a progenitor cell population composed of lateral plate mesoderm and definitive endoderm progenitors, which, in the case of PECs differentiation protocol, was responsible for the generation of a small population of CDX2+ gut-like epithelial structures in PECs aggregates.